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桃红四物汤对脑缺血再灌注损伤大鼠血脑屏障通透性的保护作用及机制.pdf


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】的内容,可以使用淘豆网的站内搜索功能,选择自己适合的文档,以下文字是截取该文章内的部分文字,如需要获得完整电子版,请下载此文档到您的设备,方便您编辑和打印。万方数据桃红四物汤对脑缺血再灌注损伤大鼠血脑屏障通透性的保护作用及机制侯欣宇,刘竹青,张亚南,戴文涛,武瑞,韩岚?,彭代银。黰恚脑卒中发病的机制是脑血管闭塞阻碍大脑局部血流,致使血流供应障碍,脑动脉内形成血块,引起脑组织的缺血、低氧,导致一系列级联反应以及局部脑组织缺血性损伤或坏死Q芯勘砻鳎毖G液供应的恢复,反而致使缺血区损伤加重,即脑缺血再灌注损伤,出现脑水肿⑸窬δ苋彼餥、血脑屏障破坏统鲅P宰;痆,威胁患者的生命健康。血脑屏障是由单层的脑微血管内皮细胞、围绕在内皮细胞表面的星形胶质细胞和周细胞组成能够调节循环血液和脑实质之间物质的转运,维持中枢神经系统稳态。研究砻鳎宰渲谢嶂率怪枢神经系统血管功能变化,引起血脑屏障结构和功能损伤,导致血脑屏障破坏,而血脑屏障的破坏进一步导致血管源性脑水肿和出血转化。,从而加剧脑卒中后脑损伤。脑卒中属于中医“中风”“偏枯”或“偏风”等范畴,病机属气虚血瘀。桃红四物汤最早见于《医宗金鉴》,由桃仁、红花、川芎、当归、熟地黄、白芍吨幸┳槌桑2寡5骶⒒钛!㈧铕觥⑸新的经典名方。课题组前期研究证实,桃红四物汤对缺血性脑卒中具有保护作用,可降低脑卒中炎症反应,保护正常神经功能以及促进血管新生,但桃红四物汤保护神经功能的作用是否与改善血脑屏障通透性以及紧密连接蛋白损伤有关尚不明确。本研究拟复制大鼠大脑中动脉阻塞琈模型,观察桃红四物汤对脑缺血再灌注损伤大鼠血脑屏障通透性的影响,探究其保护神经功能作用是否与减少紧密连接蛋白损伤,改善脑组织超微结构有关。材料动物缎坌越】荡笫唬逯柿±,购于邳州市东方养殖有限公司,动物生产许可证号为一。每笼只,自由活动,饮食饮水,保持室内通风,室温℃,湿度ィ视π晕寡K卸实验均经安徽中医药大学动物实验伦理委员会批准R猐目的观察桃红四物汤对脑缺血再灌注损伤的治疗作用,以及其对血脑屏障的保护作用和机制。方法物汤给药后呈现改善的趋势。峁允荆肽P妥楸冉希液焖奈锾烙肽崮5仄阶榇笫竽怨K烂婊飨约跎缩,核固缩、分裂或溶解,细胞排列紊乱,层次不清晰的情况得到改善。与模型组比较,桃红四物汤与尼莫地平组大机制可能与改善血脑屏障紧密连接超微结构,减少紧密连接相关蛋白表达,进而降低血脑屏障通透性有关。..—...通信作者:韩岚,女,博士,教授,.://.,安徽合肥;幸└捶桨不帐≈氐闶笛槭遥不蘸戏掳惨窖Ы逃恐氐闶笛槭遥不蘸戏建立左侧大脑中动脉阻塞模型,将大鼠随机分为假手术组、模型组、桃红四物汤组和尼莫地平组。采用婪址观察大鼠神经功能损伤程度,行为学实验观察大鼠的运动神经功能,,宦然交牡_“,染色法观察大鼠脑梗死面积,苏木精伊红染色观察大鼠缺血侧脑部皮质组织病理变化,干湿法测定脑含水率,伊文思蓝,嘧⑷旧ǚ?觳庋D云琳贤ㄍ感裕干涞缱酉晕⒕倒鄄煅D云琳辖裘芰超微结构,免疫组织化学法检测脑组织紧密连接蛋白、胞质附着蛋白一,—和基质金属蛋白酶,表达水平。,与模型组比较,桃红四物汤与尼莫地平组大鼠脑皮质组织神经元细胞质浓鼠脑含水率、、—鞍妆泶锼较灾撸琈一泶锼较灾档。透射电子显微镜观察发现,模型组大鼠血脑屏障紧密连接明显受损,桃红四物汤组和尼莫地平组大鼠血脑屏障紧密连接损伤明显改善。结论桃红四物汤可改善脑缺血再灌注损伤大鼠神经功能,缩小梗死面积及减轻脑水肿。其作用丶蔧桃红四物汤;脑缺血再灌注;血脑屏障通透性;紧密连接蛋白;神经功能基金项目:国家自然科学基金项目话不崭咝W匀豢蒲а芯肯钅作者简介:侯欣宇,女,硕士研究生甤万方数据桌肀嗪牛篈—一药材及试剂桃仁⒑旎批号⒋ㄜ批号⑹斓鼗批号、当归桶咨批号┎木河诎不掌杖手幸┮邢薰荆其有效成分均符合年版《中华人民共和国药典》标准。尼莫地平:亚宝药业太原制药有限公司;,宦然交牡_,、ザ嗑奂兹⒘姿嵫位撼逡,粉末:碧云天生物技术有限公司;臿、胞质附着蛋白琙一批号⒒质金属蛋白酶一批号:英国锛际跤邢薰荆:上海恒远生物技术有限公司。仪器狣循环水式多用真空泵:郑州市仪特仪有限公司;一旋转蒸发器:上海亚荣生化仪器有限公司;猀超纯水机:上海默克化工技术有限公司;制冰机:南京先欧仪器制造有限公司;橹衅航鸹J锌频弦瞧魃璞有限公司;一阄抡竦磁嘌洌撼V萁懿森仪器有限公司;全波长酶标仪:美国公司;低温冷冻离心机:湖南湘仪实验仪器开发有限公司;咚倮涠忱胄幕旱鹿鶨公司。桃红四物汤的制备将红花、当归、白芍、川芎、桃仁、熟地黄按照::比例配制。将称量的各药材加入倍容积的%的无水乙醇中,浓缩后回流瞬杏辔铩=ú杏辔镉倍容积的无水乙醇回流次提取物合并,浓缩后制成痬奶崛∫海∈,将大鼠麻醉后,仰卧固定。在大鼠颈部中间位置切口,分离左颈总、颈内和颈外动脉。在颈总和颈外动脉的靠近心脏一端处进行结扎,使用动脉夹将颈内动脉紧闭。从颈总动脉的远心端嗑蹦诤途蓖舛龇植娲处眉舻都粢恍】冢迦牍蟮挠阆直径为>弊芏霾迦刖蹦诙觯肼凇颈总动脉和鱼线共同结扎,缝合皮肤,碘伏无菌操作。注射庆大霉素,大鼠俯卧保持呼吸通畅。蟀纬鱼线,再灌注<偈质踝榇笫笾唤嵩蓖舛鲇颈内动脉。手术期间注意给大鼠保暖。分组及给药将大鼠随机分为假手术组、模型组、桃红四物汤组和尼莫地平组,每组只。桃红四物汤组按照痥根据人和动物间体表面积折算的等效剂量比值计算,大鼠的剂量相当于***临床剂量的倍辔柑液焖奈锾溃崮5仄阶榘凑/灌胃尼莫地平。假手术组和模型组大鼠均给予等容积蒸馏水,共咳次。旨镀婪制拦来笫笊窬δ评分标准:叮形N廾飨员浠级,左前肢屈曲,左后肢伸展;叮凶蟛嘧肺蚕窒螅级,行走困难,摇摆不定;叮拮苑⑿曰疃幸馐墩****行为学实验评估大鼠运动功能平衡木试验术前衅胶饽拘凶哐练,使每只大鼠都能够顺利通过平衡木,限时评分标准:郑榷ㄆ胶庾耸疲分,紧抱平衡木;分,其中一个肢体从平衡木上掉落;郑礁鲋从平衡木上掉落;郑奘酝计胶馊吹郑酝计胶馊吹;郑酝计胶馊吹落.=鞘匝榻ù笫笾糜诹娇檠强肆Π寮薪至尾部垂直线的后~处,使大鼠能够前进,总共进行次,记录小鼠左转或者右转次数。转角指数一茏=谴问幌蜃笞=堑拇问/总转角次数×ァ旧ǚü鄄炷匀毖4笫竽怨K烂积腹腔注射ノ彀捅韧啄坡樽泶笫螅〕鐾暾脑组织,去除小脑、嗅球等组织,只保留大脑,置一℃冰箱里笄衅湃%芤海下避光孵育约H旧ê笾糜%多聚甲醛固定,舐酥轿杀砻鞑辛羧芤骸2捎肐软件计算各组大鼠脑梗死面积。苏木精伊红—琀染色观察缺血侧脑部皮质的组织形态腹腔注射ノ巴比妥钠麻醉大鼠后,打开胸腔,生理盐水进行心脏灌注%多聚甲醛固定液再次灌注〕鐾暾宰橹コ∧浴⑿崆虻茸橹槐留大脑,浸泡于ザ嗑奂兹┕潭ㄒ褐校℃保存。脱水处理后石蜡包埋,切片,染色,封片,显微镜下观察缺血侧脑皮质的组织形态并采集图像。大鼠脑组织含水率检测腹腔注射ノ彀比妥钠麻醉大鼠后取完整大脑,生理盐水冲洗,将全脑组织分成左、右两个半球,滤纸吸干表面的生理盐水,将缺血侧脑组织放在电子天平上称质量,记录缺血侧脑组织湿质量,放入婧婵鞠浜娓烘干后再次称质量,记录缺血侧脑组织干质量。脑含水率一V柿恳桓芍柿/湿质量×ァ琈一方法://.;。..万方数据广薹:奏一①,’、:凄』·琹■苣睢#汗鷏浚兀圆。·痩伊文思蓝,旧ǚü鄄炷匀血大鼠血脑屏障通透性大鼠尾静脉注射サ染色液。/逖螅骨蛔⑸%戊巴比妥钠麻醉大鼠,经心脏灌流,观察大鼠心脏右心耳滴出无色透明液体后,取脑,称取脑组织将脑组织放入管内加入甲酰***溶液泡。加入研磨球,放入组织研磨仪中低温匀浆,匀浆后取出,在℃孵育7湃温离心机,胬胄∩锨逡骸N∩锨逡『上尤装澹副暌处渎取吸光度怠V票窫曜计放ǘ惹撸扑阊放ǘ取出血性转化程度测量大鼠腹腔注射ノ巴比妥钠麻醉后用泄嘧ⅲ鄄煊倚亩鱿无色透明的液体后迅速断头取脑,手术刀分离两侧大脑半球,收集缺血半球脑组织并称取脑组织约。加入禤快速匀浆,胄∩锨濉H荌。上清加入孔板中,按照血红蛋白检测试剂盒说明书测定上清液中血红蛋白透射电子显微镜观察脑缺血大鼠血脑屏障紧密连接超微结构取小鼠脑缺血侧皮质区大小的脑组织,固定于%戊二醛溶液,姹4妫弃去原有固定液,将样本装入瓶中,经垂夜;再经逑次,固定于ワ八幔琍清洗和ヒ掖冀型阉看Fノ匏醇后,加入ケ=浮1S胧髦凑誰:例作用晃:谋壤饔淮渴髦包埋过夜。切片,染色,透射电子显微镜下观察血脑屏障紧密连接超微结构并采集图像。免疫组织化学染色法观察脑组织紧密连接蛋泶锼将大鼠麻醉、取脑,ザ嗑奂兹┕潭ǎ瘢衅:婵妆浇础R来卧%、%、%、%乙醇中浸洗琍清洗。放入枸橼酸盐中处理,逑础7湃%阂患状既芤捍恚琍清洗。加入一抗,放淅锓跤埂H〕銮片,。加入二抗,孵育琍清洗。加入显色剂和苏木精染液。依次在%、%、%和ヒ掖中浸洗,二甲苯浸洗,封片。。各实验均重复进行魏螅臣剖葑柿希实验数据采用“均数±标准差荨纒苯型臣蒲述。多组均数总体比较采用单因素方差分析,均数多重比较采用检验。对于方差不齐或不符合正态分布的计量资料采用非参数检验。以2钜煊型臣蒲б庖濉各组大鼠神经及运动功能比较假手术组大鼠神经及运动功能元明显损害。与假手术组大鼠比较,模型组大鼠神经功能严重受损,⒊晒Γ惶液焖奈锾雷楹尼莫地平组大鼠神经和运动功能明显改善各组大鼠脑梗死面积比较假手术组大鼠脑部可见鲜艳的红色,无苍白色区域,未见脑组织损伤;与假手术组比较,.<。各组大鼠脑皮质的组织形态比较假手术组大鼠脑皮质神经元结构完整、轮廓清晰,无明显病理变化;模型组大鼠缺血侧大脑皮质大量神经元出现结构破坏,细胞质浓缩,细胞核固缩、分裂甚至溶解。/浸痬的低含量。巍R来伟凑ァァァァァ白。蚆结果.<。蠢鋈暴逛好辩://.。组别求俅注:;;与假手术组比较,”挥肽P妥楸较,图各组大鼠神经及运动功能比较±琻一鄹工注:;;与假手术组比较,”.挥肽P妥楸冉希图髯榇笫竽怨K啦≡钋衅左图凸K面积定量图彝染色,纒.”一∞加求拳黑求&口。!万方数据霾一广厂墨蛩:謦的状态。并且神经元之问的排列杂乱、层次不清晰、问质水肿,病理损伤严重。桃红四物汤和尼莫地平组大鼠脑皮质的病理损伤均有所改善。见图各组大鼠脑组织含水率及山血性转化程度比与假于术组比较,模型组大鼠脑组织含水率、,。见图各组大鼠血脑屏障通透性比较假手术组渗出量较低,模型组的渗出量明显增加,即血脑屏障通透性增加。与模型组比较,桃红四物汤组和尼莫地平组大鼠脑内渗出含量明显降低.<。各组大鼠血脑屏障紧密连接超微结构变化比较假手术组大鼠内皮细胞之间相邻的紧密连接呈现一条单独且明显的暗线,内皮细胞问紧密连接数量较多,细胞间隙狭窄,大鼠无血脑屏障的破坏。模型组大鼠的紧密连接数量减少,蛋白层变薄且不连续,细胞问出现问隙,内皮细胞水肿。桃红四物汤组和尼莫地平组细胞问紧密连接超微结构的异常变化明显减弱。见图盖各组大鼠紧密连接相关蛋白表达水平比较假手术组比较,模型组大鼠脑梗死区、—⑼。脑卒中属中医学“中风”范畴,脑卒中病理过程中产生的许多物质,如凝血酶、细胞因子等都可归纳为中医理论“瘀”的范畴,这些物质可以损伤血管内皮细胞、血脑屏障结构等,影响脑组织正常功能,并与脑卒中的不良预后密切相关。故在治疗、用药方面以祛瘀血、生新血、畅气机等法互相配合,辨证应用,祛除瘀阻,通畅气机。血脑屏障在维持大脑中枢神经系统的特殊微环境及与全身多脏器交流中发挥着重要作用。血脑屏较面与讨论://..■注:;;崮地平组大鼠缺血侧大脑皮质的组织形态比较旧ǎ工组别注:;;与假手术组比较,。挥肽P妥楸冉希图髯榇笫竽院考俺鲅P宰;潭缺冉酪唬币号地平组;与假于术组比较,“挥肽P妥楸冉希各组大鼠血脑屏障通透性比较±币注:;?肺=,、‘十’万方数据瞧萋,。郏‘≥≤‘鬻薹雾鬻黎鍪漤鬻瓣蔫潴~罐弧∥簿卜≮一臻一鬻蕊譬舔鞴硝曩一一~麓警东≯蜇。;环:.。。眉,¨¨踨障破坏是早期缺血性脑卒中的特征之一,血脑屏障受到破坏致使脑部损伤和后续的神经功能损伤。此外,其生化特征包括减少紧密连接所组成的蛋白表达,改变紧密连接组织结构,调节内源性血脑屏障越来越多的研究表明,血脑屏障的破坏与脑血管疾病密切相关,如脑出血、脑梗死、癫痫、动脉粥样硬化”和神经退化。研究”表明,动物脑卒中模型的出血性转化和脑水肿的发病机制可能由于血脑屏障的破坏而重叠。在内皮功能障碍的过程中,组织肿胀首先是血管内液的渗透,经毛细血管运动进入细胞外问隙胱有运,随后进行血脑屏障的破坏,即紧密连接受损和血浆蛋白渗漏9茉葱运肿詈笫敲秆9芡暾缘乃鸹岛屯馍侥允质。研究?⑾郑贛后9芘允抵食现严重的组织水肿,微血管和基底膜的内膜结构模糊。同时,大鼠出现神经功能缺损、脑水肿、梗死体积扩大等情况。此外,脑微血管内皮细胞具有高度特征化的表型,其特征是细胞间紧密连接,紧密连接主要由细胞跨膜蛋白⑾赴附着蛋白和连接黏附分子组成。这些紧密连接限制了分子在血液和脑之问的移动与扩散,在内皮层形成一道屏障,即相邻的脑微血管内皮细胞的膜结构紧密相连。、和是反映血脑屏障功能的关键指标。***和的细胞质尾端连接到肌动蛋白细胞骨架,以维持紧密连接结构【“Q芯縖表明,大脑中动脉闭塞/再灌大鼠缺血区星形胶质细胞端足不同程度肿胀。大鼠毛细血管内皮细胞之间的紧密连接结构变形,出现间隙裂隙。可见,血脑屏障在脑缺血后呈现明显的病理变化,与脑缺血疾病的进展及预后密桃红四物汤是祛瘀生新的经典方剂,具有活血化瘀功效。桃红四物汤组成成分复杂,这也决定了其具有多种药理作用。目前,桃红四物汤的主要研究都是围绕着治疗血瘀相关疾病展开,包括活血化瘀、抗炎镇痛、神经保护等。研究”发现,桃红四物汤能够降低血瘀证缺血性脑卒中患者血压和毛细血管通透性,扩张梗死的脑血管,增加脑部血流量,从而改善脑部的微循环。课题组以往研究也表明,桃红四物汤可以减少氧化,缓解损伤,改善学****和记忆功能口俳毖P阅宰渲醒9苌伞。嘲,抑制炎症与细胞焦亡!盝。本实验结果发现,桃红四物汤能够改善缺血再灌注大鼠神经及运动功能,缩小疪大鼠缺血侧脑梗死面积,改善大鼠梗死区脑皮质病理损伤,减轻疪大鼠脑水肿,调节血脑屏障通透性,修复内皮细胞问紧密连接结构,提高、籰表达水平,降低蛋白的表达水平,改善出血性转化程度及恢复脑血流量,调节血脑屏障通透性,对脑缺血再灌注损伤具有良好的保护作用。膨。“。一琽■偈质踝转运蛋白的功能。注切相关。://.:与假手术组比较,。;与模型组比较,。.各组大鼠谋泶锼奖冉。参考文献:图±琻一藌人.—万方数据瓻籉甆,,瑆甴://畂/./甤..甋:┐笱В——琫—...://.://畂/./甆,琀/甁:..—://畂/./珼甆轈琁...,,/://畂/./産张超,彭先波,王晓玲,,,:一./:./://./琇/瓼崭迦掌冢—,.癳,:—.珼甌,,:瑉...琍.:,,:,,::,,:琍:—.瓵’篔:,,琓.—琂珻瑂.—琀...皌——...,,万方数据/黰狟保琖安徽中医药大学学报第卷第月://.”,”,”,,保琍,,,.瓾../籅.,.,.,猙琣.】Ⅵ琣琺琓,;;;猟癳;癳籭,一琣皒甌瑃琸,,卜琣.,瑀﹊.籧;;痑籈.—

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