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aseaminoacyltransferase◆mⅢeBiosynthesis◆ABCtraFtsportd"Flippase≥hypometlcalproteklpolymerBation—dm№nmhpolymerBation—dm№nmh●TyosmeIona∞◆乳糖●黼却㈣OOCDC>C)000000000∞(渗透酶)(渗透酶1OOOOOOOOOOOOOOOOE1E5E6眦似似D一●H—D一●●一6PE2E6E7飙㈨“一D●a—D-6p-●●一伊◆黼E3E8E7●葡萄糖“D—lP一-“一D一1P一●。rn“rn“●半乳糖-十nW目ElE4渺一一E10geUDP一■UDP.●E1:卢一半乳糖苷酶;E2:醛糖1一差向异构酶;E3:半乳糖激酶;印E4:UDP一糖焦磷酸化酶;E5:乳糖酶一根皮苷水解酶;E6:葡萄糖激酶;E7:葡萄糖磷酸变位酶:E8:UDP一葡萄糖一己糖一㈣1一磷酸尿苷酰转移酶;E9:U7rP一葡萄糖一1一磷酸尿苷酰转移酶;EIO:UDP一葡萄糖一4一差向异构酶。㈣瑚㈣瑚㈣示。菌落PCR的扩增结果如图4所示。图4西落PCR的扩增电冰图电泳结果显示,(1677bp)长度吻合。菌落PCR结果度为5369bp,但是电泳图中的克隆片段为4000~表明该载体成功转化到大肠杆菌中。pET28a-pgm7000bp,这是由于在4000~7000bp区域中质粒重组表达载体构建及双酶切电泳结果如图5所示。超螺旋形式的比例最大,与线状DNA和开环DNA在图5中,1号泳道为空pET一28a质粒载体,长相比,超螺旋DNA电泳速度最快,因此4000~5000万方数据:..张文丽,等:长双歧杆菌A17胞外多糖合成基因簇的分析2000l000750500250100M1:lkbDNALadder;1:pET28a质粒;2:空pET28a质粒酶切产物;3、4:pET28a-pgm重组表达载体;M2:DL2000Maker;5、6pET28a-pgm重组表达载体酶切产物:7、8:pET28a-pgm重组表达载体PCR产物;9、10:pgm基因PCR扩增产物。图5pET28a--binantexpressionvectorconstructionandrelatedproductsbp出现最亮的条带。2号泳道为空载体双酶切产物,~6000bp出现最亮的条带。3、4号泳道的扩增片段000长度大约7000bp左右,与pET28a-pgm重组表达}7O50载体序列长度的6974bp吻合。5、6号泳道为4OpET28a-pgm重组表达载体的双酶切产物,电泳图3O中pgm基因浓度太低,条带不明显。7、8号泳道为2O—1弘弘脏脏弘脏弘弘弘OpET28a-pgm重组表达载体的PCR产物,扩增片段1:亲和层析目的蛋白质;2:亲和层析杂蛋白质;M:Marker。大小在1700bp左右,符合pgm基因长度。9、10号图7亲和层析纯化结果泳逍作为阳性对照(A17中pgm基因的PCR扩增产:物)。—p聊重组表达载体的测序结果目的蛋白质的相对分子质量约为60000左右,BLASTx比对分析,,证明重组表60000左右没有蛋白质,IPTG诱导的上清液和沉淀达载体中的pgm基因就是EPS合成过程中编码葡中60000处有条带,说明重组大肠杆菌成功表达了萄糖磷酸变位酶的关键基因。目的蛋白质,,说明蛋白质主要在上清液里。活化重组成功的大肠杆菌,用IFFG诱导其表对含目的蛋白质的上清液进行His—tag亲和层达目的蛋白质。诱导后离心菌液,对上清液和沉淀析,纯化蛋白质,层析产物浓缩电泳,1号泳道中出分别进行SDS—PAGE电泳,结果如图6所示。诱导现目的条带,2号泳道是层析中出现的杂蛋白质。利产物用His—tag亲和层析纯化,结果如图7所示。用AKTPurifler分子筛去除杂蛋白质,×105(95%)的目的蛋白质。13×××10455×104采用最为常见的Bradford法进行测定,××104品均3次重复。将BSA作为标准品,该法所测定的25×~15¨∥mL范围内保持线5×104性关系。测定目的蛋白质浓度的标准曲线为:y=1:未经诱导上清液;2:IPTG诱导上清;3:IPTG诱导沉淀;MMarker。.———.;.::+,浓缩后蛋白质测定的OD值为:y=(平均值),。-inducedproteinexpression蛋白质是经过稀释100倍后测定的,故计算得重组万方数据:..ZHANGWenli,etal:,目的蛋白输出[201。乳酸菌的EPS生物合成由eps基因簇调控,质表达量较高,可实现量产。决定EPS重复单元的合成、聚合、输出等过程。在本研究中经过一系列生物信息学分析发现。EPS的生物合成与一个关键的基因相关,在乳酸菌当中通过过因为双歧杆菌在肠道中可以抑制有害细菌,改表达该基因使胞外多糖的产量有较大幅度的提升。善胃肠道屏障功能【21].长期以来一直被用作益生菌双歧杆菌eps基因簇没有像LAB‘‘保守”eps基因簇来改变肠道菌群组成以缓解各种疾病。【11].本研究中表明。双歧杆菌可改变树突状细胞的功能,以调节在与其它双歧杆菌eps基因簇进行比较时也发现这肠道对无害抗原和细菌的免疫稳态,或启动针对病一点,说明单一研究某一种双歧杆菌来推断其它双原体的机体保护措施[22-251。据报道,很多双歧杆菌会歧杆菌的eps基因簇是不可取的,。结合作者所在实验室前期长双及对宿主健康的维护。受到了科学界相当大的关注【2q。。中发挥有益的作用圈。然而,值得注意的是,由于双在乳酸菌及其亚种当中,提高胞外多糖产量的歧杆菌EPS的产率低,这些聚合物作为市售益生元途径可通过优化发酵条件,例如改变培养温度、优添加剂的用途非常有限[261。可通过优化发酵条件例化发酵时间、碳源等来实现。为了提高双歧杆菌胞如优化发酵时问、pH、培养温度、碳氮源等或者通过外多糖产量低的问题,通过选取pET28a重组表达基因工程技术等来提高胞外多糖产量。在进行基因质粒实现了葡萄糖磷酸变位酶的大量表达,为从分工程改造菌株时可通过超量表达EPS合成途径中子手段调控双歧杆菌EPS的产量提供了新的途径。的基因例如磷酸葡萄糖变位酶(pgm)、UDP一葡萄糖将以往解决胞外多糖产量问题从传统的优化培养焦磷酸化酶(耐U)等来提高EPS产量,以期解决双条件上升到选取拷贝数与表达效果兼优的质粒。大歧杆菌作为一种益生菌但其胞外多糖产量低下的大缩短了实验时问,更快更高效解决胞外多糖产量问题【砌]。低下的问题,对后续开展针对双歧杆菌及其EPS功EPS的合成是一个很复杂的过程,包括糖进入能研究以及进一步阐明双歧杆菌EPS生物合成具细胞质、前体糖核苷酸的形成以及胞外多糖合成与有重要意义。参考文献[1]YENCH,KUOYW,TSENGYH,-haridessupplementationonfecalbifidobacteriaandindexofperoxidationstatusinconstipatednursing-homeresidents:aplacebo-controlled,diet-controlledtrial[J].Nutrition,2011,27(3):323—328.[2]YP,NORRISRF,[J].ArchivesofBiochemistryandBiophysics,1954,48(1):193—201.[3]FANAROS,CHIERICIR,GUERRINIP,[J].ActaPaediatrica,2003,91(441):48—55.[4]ZWIELEHNERJ,LISZTK,HANDSCHURM,binedPCR—DGGEfingerprintingandquantitative-PCRindicatesshiftsinfecalpopulationsizesanddiversityofBacteroidesbifidobacteriaandClostridiumclusterIVininstitutionalizedelderly[J].ExperimentalGerontology,2009,44(6/7):440—446.[5]BIAGIE,NYLUNDL,CANDELAM,,andbeyond:gutmicrobiotaandinflammatorystatusinseniorsandcentenarians[J].PLoSOne,2010,5(5):e10667.[6]江建平,刘洋,张亮,[J]食品工业,2015,36(10):201—,L1UY,ZHANGL,[J].TheFoodIndustry,2015,36(10):20l一206.(inChinese)[7]NICHOLSONJK,HOLMESE,,mammalianmetabolismandpersonalizedhealthcare[J].NatureReviewsMicrobiology,2005,3(5):431-438.[8]:rationale,putativemechanisms,andevidenceofclinicalefficacy[J].万方数据:..张文丽,等:长双歧杆菌A17胞外多糖合成基因簇的分析JournalofClinicalGastroenterology,2006,40(3):264—269.[9]TANABES,KINUTAY,-17productioninmurinesplenocytesanddextransodiumsulfate-inducedintestinalinflammation[J]InternationalJournalofMolecularMedicine,2008,22(21:181—185.[10]CASTRO—BRAVON,WELLSJM,MARGOu正SA,[J].FrontiersinMicrobiology,2018,9:2426.[11]HIDALGO—CANTABRANAC,SANCHEZB,MILANIC,[J].AppliedandEnvironmentalMicrobiology,2014,80(1):9-18.[12]李敏,李伟程,刘亚华,[J].中国食品学报,2021,21(4):256—,UWC,L1UYH,[J].JournalofChineseInstituteofFoodScienceandTechnology,2021,21(4):256—266.(inChinese)[13]STINGELEF,NEESE