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一种从人羊膜中制取干细胞的方法.docx


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】的内容,可以使用淘豆网的站内搜索功能,选择自己适合的文档,以下文字是截取该文章内的部分文字,如需要获得完整电子版,请下载此文档到您的设备,方便您编辑和打印。一种从人羊膜中制取干细胞的方法一种从人羊膜中制取干细胞的方法本发明一种从人羊膜中制取干细胞的方法,具体指一种羊膜中分离上皮细胞和间充质干细胞方法,涉及细胞分离【技术领域】。通过自制的无菌、高效、稳定的胎盘保护液对胎盘进行采集,利用消化法和爬片法的组合,将羊膜上皮细胞与羊膜间充质干细胞分离开来,分别得到高纯度的羊膜上皮细胞和羊膜间充质干细胞。本发明解决了现有技术中存在人羊膜采集污染率高、采集后的细胞活性差,直接影响了后续的细胞分离及培养的问题。是对从人羊膜中分离干细胞的方法进行改良和创新,形成了一套标准化的分离方案,能够更稳定,充分利用羊膜的干细胞资源,无污染,纯度高,细胞数量更多,在保持细胞活性的同时,保证了干细胞的原始特性。【专利说明】—种从人羊膜中制取干细胞的方法【技术领域】[0001]本发明涉及一种细胞分离技术,尤其涉及一种羊膜中分离上皮细胞和间充质干细胞方法。【背景技术】[0002]羊膜是胚胎期发育的产物,羊膜细胞具有干细胞特性,且不表达人类白细胞抗原HLA-1及HLA-1I,无异体免疫排斥反应,因此适合用于细胞治疗,羊膜中的干细胞主要有上皮细胞和间充质干细胞。羊膜上皮细胞具有亚全能干细胞特性,其分化能力强,可向三个胚层分化,并且无致瘤性及伦理学问题,是组织工程和细胞治疗的理想种子细胞。羊膜间充质干细胞有一定多向分化潜能,但相对羊膜上皮细胞其特点主要在于其具有免疫调节及促进造血恢复的功能。这两种细胞各有特点且在羊膜中含量丰富,因此探索有效可行的从羊膜中分离这两种细胞的方法,具有十分重要的意义。目前广泛使用的酶解法利用胰蛋白酶及胶原酶将羊膜进行消化,并将消化产物接种培养,从而获得羊膜中的干细胞。但是使用胰蛋白酶对细胞损伤过大、消化时间长,导致消化下来的细胞不易贴壁生长,细胞成活率低,而消化时间短又不能得到足够的细胞。另外,分步多次消化会增加操作污染的几率,并使得分离步骤繁琐,且得到的细胞不纯,成功率低。【发明内容】[0003]本发明公开了一种从人羊膜中制取干细胞的方法,用以解决现有技术中羊膜采集污染率高、采集后的细胞活性差,直接影响了后续的细胞分离及培养的问题。[0004]本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的:一种从人羊膜中制取干细胞的方法,其中,包括采集,分离,培养,冻存,检测;其中,分离过程中,羊膜上皮细胞采用酶消化法,继而羊膜间充质干细胞采用组织爬片法,两者分步连续完成。[0005]如上所述的一种从人羊膜中制取干细胞的方法,其中,所述采集包括:将采集的胎盘,/升青霉素的D-Hanks液胎盘保护液的无菌袋内,将无菌袋进行密封并放入采集盒,将采集盒放入恒温采集箱,在24小时内将恒温采集箱送至干细胞库。[0006]如上所述的一种从人羊膜中制取干细胞的方法,其中,所述恒温采集箱具体温度为2V~8°C;所述采集胎盘至送入干细胞库的时间为12小时内。[0007]如上所述的一种从人羊膜中制取干细胞的方法,其中,所述羊膜上皮细胞的分离具体包括:将胎盘平铺在面积为400cm2圆盘内,用生理盐水将血丝冲洗干净;用手术剪剪取整个正面的羊膜;将羊膜放入面积为200cm2的圆盘中,使之铺展开,用止血钳除去羊膜上的血丝后,放入烧杯中,用生理盐水冲洗5飞次,每次使用100毫升~150毫升生理盐水;之后通过酶消化法对羊膜进行处理,所述酶消化法具体包括:将经生理盐水冲洗后的羊膜放入第一血浆瓶中,;37°C恒温静止消化,使整块羊膜完全与胰蛋白酶充分接触后,经37°C恒温静止消化8分钟~12分钟;将羊膜取出,弃消化液,将羊膜置于第二血浆瓶中,,使整块羊膜完全与胰蛋白酶液充分接触后,经37°C恒温静止消化10分钟~20分钟;消化结束后,~I分钟至消化液变为乳白色浑浊液体,再向其中加入2毫升胎牛血清终止消化;用止血钳夹起羊膜,用100毫升生理盐水冲洗一遍后,收集消化液和冲洗液,并用100目细胞筛过滤;将所得细胞悬液进行细胞计数,%台盼蓝混匀后,用移液器打入血球计数板中,静置I分钟后,显微镜下观察计数;过滤后的液体分装于50毫升离心管中,经300G~800G离心机工作5分钟;将离心所得细胞用含5%,或使用DMSO直接冻存。[0008]如上所述的一种从人羊膜中制取干细胞的方法,其中,计数过程中对细胞数进行判断,;否则进行培养,。[0009]如上所述的一种从人羊膜中制取干细胞的方法,其中,所述冻存的具体包括:,,于4°C环境下静止30分钟以上;向离心后的细胞中加入全部的混合液(),再向其中加入9毫升的胎牛血清混匀后,平均加入9个冻存管中,;将所述冻存管置于4°C中10分钟后,放入液氮罐长期保存。[0010]如上所述的一种从人羊膜中制取干细胞的方法,其中,在第一血浆瓶中最佳恒温静止消化的消化时间为10分钟;在第二血浆瓶中最佳恒温静止消化的时间为15分钟;消化结束后,最佳搅拌时间为I分钟。[0011]如上所述的一种从人羊膜中制取干细胞的方法,其中,对获得的羊膜上皮细胞进行检测,如果发现羊膜上皮细胞中混有羊膜间充质干细胞,则进行如下处理:去除第一培养瓶中的培养液,用10毫升生理盐水冲洗2遍;,经37°~;在显微镜下观察羊膜间充质干细胞,当细胞全部消化下来后,;向第一培养瓶中加入10毫升生理盐水,混匀后收集培养瓶中的细胞悬液,将收集到的液体经200G离心工作5分钟;收集到的羊膜间充质干细胞经计数,接种于培养瓶中,若细胞数在6XIO6以下接种于T25的培养瓶中,细胞数在6XIO6及以上接种于T75的培养瓶中,加入培养液继续培养;第一培养瓶中的羊膜上皮细胞加入含5%;如上所述的一种从人羊膜中制取干细胞的方法,其中,所述羊膜间充质干细胞的分离方法包括:采用整块组织爬片法,将消化剩余的羊膜放入第一烧杯中,用50毫升生理盐水反复冲洗3次,冲洗后的羊膜置于第二烧杯中晾干;培养:将整块羊膜铺展在T75培养瓶中,如果羊膜块面积大于培养瓶底面积,可以将羊膜块剪成2-3大块,分别铺展在另外培养瓶中,经37°C培养箱中恒温放置3小时后,缓慢加入5毫升的DMEM/F12(含10%)培养液将羊膜块组织润湿培养;6天后,全量换液,待细胞爬出至细胞长满培养瓶底面积的30%及以上后,进行传代操作,传代后细胞可进行冻存或用于实验研究。[0012]如上所述的一种从人羊膜中制取干细胞的方法,其中,采用碎块组织爬片法,将消化剩余的羊膜放入第一烧杯中,用50毫升生理盐水反复冲洗3次,冲洗后的羊膜置于第二烧杯中用手术剪将其剪碎至I毫米3的小块;培养:用药勺将剪好的羊膜块均匀地铺展在T75培养瓶中,,每个T75培养瓶接种200块羊膜组织,经37°C培养箱中恒温放置3小时后,缓慢加入10毫升的DMEM/F12,DMEM/F12含10%,培养液将所有羊膜组织润湿培养。[0013]6天后,全量换液,待细胞爬出至细胞长满培养瓶底面积的30%及以上后,进行传代操作,传代后细胞可进行冻存或用于实验研究。[0014]如上所述的一种从人羊膜中制取干细胞的方法,其中,对羊膜上皮细胞和羊膜间充质干细胞的微生物进行检测,具体包括:需氧厌氧菌检测:将打入细胞培养液的需氧厌氧菌培养瓶一对的条码扫入血培养仪并且编好号码,上入到血培养仪内观察,检测7天,7天后如果结果为阴性即出具细菌检测合格报告,如果检测结果为阳性,则出具阳性报告;支原体检测:配置两种培养基,支原体肺炎培养基和半流体培养基,将配置好的培养基121.(TC灭菌15分钟,然后进行分装,每份样品接种每种培养基两管,共四管放入36.(TC培养7天,7天以后取每种培养基一管再转种两管,与前面的四管加起来共八管培养21天,每三天观察一次结果;从接种后起28天内如果结果为阴性出具支原体检测阴性报告,如果为阳性则出具支原体阳性检测报告;如上所述的一种从人羊膜中制取干细胞的方法,其中,对羊膜上皮细胞进行验证,具体包括:通过流式细胞仪进行以下检测:CD45检测:准备两支流式管,对两支流式管进行编号,一支为质控管一支为样品管,将CD45的control试剂摇匀,向质控管中加入20微升,再将CD45试剂摇匀,向样品管中加入20微升CD45试剂,然后将样品震荡摇匀向两支流式管中各加入600微升样品,然后混匀,置于4°C左右避光孵育30分钟,然后向样品管和质控管中分别加入I毫升PBS,混匀后1500转/分钟离心5分钟,后弃去上清,加入240微升的PBS后混匀上机,检测阳性结果=2%则为合格,出具细胞表面标记物检测合格报告;HLA-DR检测:准备两支流式管,编号,其中一支为质控管一支为样品管,将HLA-DR的control试剂摇匀,向质控管中加入20微升,再将HLA-DR试剂摇匀,向样品管中加入20微升HLA-DR试剂,然后将样品震荡摇匀向两支流式管中各加入600微升样品,然后混匀,置于4°C左右避光孵育30分钟,然后向样品管和质控管中分别加入I毫升PBS,混匀后1500转/分钟离心5分钟,后弃去上清,加入240微升的PBS后混匀上机,检测阳性结果=2%则为合格,出具细胞表面标记物检测合格报告;SSEA-4检测:准备两支流式管,编号,其中一支为质控管一支为样品管,将SSEA-4的control试剂摇匀,向质控管中加入20微升,再将SSEA-4试剂摇匀,向样品管中加入20微升SSEA-4试剂,然后将样品震荡摇匀向两支流式管中各加入600微升样品,然后混匀,置于4°C左右避光孵育30分钟,然后向样品管和质控管中分别加入I毫升PBS,混匀后1500转/分钟离心5分钟,后弃去上清,加入240微升的PBS后混匀上机,测阳性结果380%则为合格,出具细胞表面标记物检测合格报告;CD29检测:准备两支流式管,对两支流式管进行编号,一支为质控管一支为样品管,将CD29的control试剂摇匀,向质控管中加入20微升,再将CD29试剂摇匀,向样品管中加入20微升CD29试剂,然后将样品震荡摇匀向两支流式管中各加入600微升样品,然后混匀,置于4°C左右避光孵育30分钟,然后向样品管和质控管中分别加入I毫升PBS,混匀后1500转/分钟离心5分钟,后弃去上清,加入240微升的PBS后混匀上机,检测阳性结果380%则为合格,出具细胞表面标记物检测合格报告;荧光定量PCR,具体检测Naneg、0ct4、Kcf4和S0X2基因的表达量,具体包括以下操作步骤:步骤一:样品RNA的抽提从-70°C冰箱取出细胞样品后,放于冰上,后转移至操净台,在细胞样品管中迅速加入I毫升Trizol试剂,将此样品管标为I号管;待I号管中细胞融化后,用I毫升移液枪反复吹打直至看不见任何不溶物,吸取I毫升细胞样品转移至2号干净无RNA酶的EP离心管中,对样品进行对应编号;两相分离:将已混合均匀的样品放在掌上离心机离心3s,使管盖的Trizol试剂进入管内;***仿,盖紧管盖;将已盖紧的2号EP管手动剧烈震荡15s,在15到30°C静置5分钟;4°C下12000r/m离心15分钟;离心后混合液体将分为下层的红色酚***仿相,中间层以及无色水相上层;RNA全部被分配于水相中;水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%;RNA沉淀:小心地从离心机中拿出已离心好的样品,放在超净台上;将2号管倾斜45°角,将水相上层转移到3号干净无RNA酶的离心管中,切勿碰到管壁和吸到中间层;加入等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA,盖紧管盖,写好与之对应的编号;轻轻颠倒5次,使之混匀;混匀后在15到30°C静置10分钟后,于4°C下12000r/m离心10分钟;此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块;RNA清洗:移去3号管中的上清液,每I毫升TRIZOL试剂裂解的样品中加入至少I毫升的75%乙醇(75%乙醇用DEPC水配制

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