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一种ic53基因产物的抗原多肽、自身抗体在心力衰竭心肌病诊断与治疗中的用途及含有...的制作方法.docx


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】的内容,可以使用淘豆网的站内搜索功能,选择自己适合的文档,以下文字是截取该文章内的部分文字,如需要获得完整电子版,请下载此文档到您的设备,方便您编辑和打印。一种ic53基因产物的抗原多肽、自身抗体在心力衰竭心肌病诊断与治疗中的用途及含有...的制作方法专利名称:一种ic53基因产物的抗原多肽、自身抗体在心力衰竭心肌病诊断与治疗中的用途及含有...的制作方法技术领域:本发明涉及一种IC53基因产物的抗原多肽、自身抗体在心力衰竭心肌病诊断与治疗中的用途及含有该多肽的试剂盒,属于生物工程领域。背景技术:心脑血管病是人类的重大健康与经济负担,每年有260万中国人死于心脑血管病,平均每12秒就有一位同胞被该病夺去生命。据统计,%,%,。据世界银行预测到2020年,%%,其中70%发生在发展中国家。中国现有高血压1亿多人,每年以350万的速度递增,脑中风致残者600万人,每年以150万的速度递增,冠心病人100万,每年以50万的速度递增,心肌病300万人。心衰是大多数心血管疾病的终末临床表现,也是主要的死亡原因。转化酶抑制剂虽然对心力衰竭有一定程度的改善,但进行性的心脏衰竭与心源性猝死,仍然是医务界当前面临的巨大挑战,从分子生物学水平上分析,理解心衰的分子发病机制,对从根本上阻止心衰的发生有十分重要的意义。IC53基因是一个从***主动脉cDNA文库中克隆到的一个新基因,生物信息学分析发现它与C53互为变位剪接体,故命名为IC53(IsoformofC53)。该基因长2538bp,,与C53相比多708bp(IC53的357-1064位),推断IC53蛋白包含419个氨基酸残基,与小鼠C53有84%的同一性,该蛋白无跨膜区,不包含任何已知的功能域。Northern杂交发现该基因有两个转录本,,在脑、心脏、骨骼肌、结肠(不含粘膜)、胸腺、脾、肾脏、肝脏、小肠、胎盘、肺、外周血白细胞、早幼粒白血病HL-60细胞系、宫颈癌细胞系S3株、慢性粒细胞白血病K-562细胞系、淋巴母细胞性白血病MOLT-4细胞系、Burkitt′s淋巴瘤Raji细胞系、结肠腺癌SW480细胞系、肺癌A549细胞系及黑色素瘤G-361细胞系中广泛表达。以IC53特异的序列(433-1065位)做探针分析,,在肝脏,外周血白细胞,早幼粒白血病HL-60细胞系,淋巴母细胞性白血病MOLT-4细胞系及Burkitt′s淋巴瘤Raji细胞系中高表达。发明内容本发明的一个目的是提供一种高灵敏度高、特异性的IC53基因抗原多肽。本发明的第二个目的是提供这种IC53基因抗原多肽在制备与IC53基因超表达相关的心力衰竭的诊断试剂和治疗药物中的应用。本发明的第三个目的是提供一种通过酶联免疫吸附方法检测IC53基因自身抗体的试剂盒,以及该试剂盒的用途。为实现上述目的,本发明采用以下技术方案IC53基因及其相关产物抗原多肽在制备检测IC53基因的试剂中的应用,其中相关产物指蛋白、肽、抗体及本基因相关的正、反义寡核甘酸和小干扰RNA(siRNAs)。一种IC53基因抗原多肽,。抗原多肽N-QKQQEALEEQAALEPKLD-C是根据IC53基因序列设计的(该序列为IC53蛋白序列的369-386位氨基酸,序列设计主要参照《精编分子生物学实验指南》第437-439页关于免疫原性肽的选择标准,化学合成。该多肽富含极性氨基酸,易暴露于蛋白表面而成为抗原决定簇,具有极强的特异性;同时,检测过程中血浆的稀释比例可低至1∶1200,灵敏度很高,包被无关蛋白时,OD值与阴性对照相当。所述的IC53基因抗原多肽在制备检测IC53基因的试剂中的应用。本发明通过原位杂交显示从***主动脉cDNA文库中克隆到的新基因IC53,在肾上腺素注射产生的亚急性心衰模型(SD大鼠)及冠状动脉结扎的慢性心衰模型(SD大鼠)的心脏中,主要在血管内皮及外膜表达,并较正常对照高。因此生物体中IC53基因表达的情况能够从一定程度上反映出与心力衰竭相关的信息,因此本发明提供了一种心力衰竭诊断的思路和方法。所述的IC53基因抗原多肽在制备诊断与IC53基因超表达相关的疾病的试剂中的应用,所述疾病为心力衰竭。所述的IC53基因抗原多肽在制备治疗与IC53基因超表达相关的疾病的药物中的应用,所述疾病为心力衰竭。其理由在于1)IC53在心衰模型的血管内皮及外膜高表达,高表达的IC53促进心肌纤维化相关基因表达,纤维化是晚期心衰的病理改变;2)心衰患者中,IC53基因自身抗体升高,说明高表达的IC53诱发的自身免疫反应参与了心力衰竭的发展,抑制这一自身免疫过程会使心衰减轻。所述的IC53基因抗原多肽在制备治疗与IC53基因超表达相关的疾病的药物中的应用,)IC53基因抗原多肽的突变体,吸附或中和IC53自身抗体或,2)用此多肽透析掉心衰病人血中高出正常人的自身抗体或,3)自身免疫的抑制药物抑制IC53自身抗体或,4)抑制IC53的表达和一种或多种药学上可接受的载体或赋型剂组成。所述药物中的抗原多肽为天然分离得到的,可从细胞提取的蛋白中获得IC53基因蛋白,如亲和层析。所述药物中的抗原多肽为化学合成得到的,可委托专业的生物公司。所述药物中的抗原多肽为通过生物工程方法制备得到的,可通过真核或原核表达方法获取IC53基因蛋白或多肽。一种检测IC53基因产物自身抗体的试剂盒,。所述IC53基因抗原多肽的浓度为5ug/ml。该试剂盒还包括以下成分1),Na2CO3,,NaHCO3,,10%硫柳***,1ml,定容至500ml,;2)封闭液3%干酪素溶于PBS;3)保温液Tris-,,,Tween-20,100ul,10%硫柳***,2ml,定容至1000ml,;4)二抗辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG;5)1×磷酸盐缓冲液1×PBS在800ml蒸馏水中溶解8gNaCl、、,,加水至1L;6)邻二苯***底物液柠檬酸,,Na2HPO4·12H2O,,10%硫柳***,1ml,定容至500ml,;7)终止液2M硫酸;8)PBST洗液1×PBS1000ml加500ulTween-20;9)邻二苯***显色液邻二苯***4mg,邻二苯***底物液10ml,30%过氧化氢20ul。所述的一种检测IC53基因的试剂盒用于诊断心力衰竭。所述的一种检测IC53基因的试剂盒用于检测心力衰竭进程中IC53基因的表达情况。所述的一种检测IC53基因的试剂盒用于开发针对IC53基因靶点的诊断和治疗心力衰竭的药物。本发明提供的试剂盒运用了酶联免疫吸附反应(ELISA)中的固相间接免疫测定法,先将抗原多肽包被酶标板,孵育后洗涤,再用3%的干酪素封闭,孵育后洗涤,然后加入待测样品(稀释后的正常人或病人血浆),孵育后洗涤,再加酶标记的二抗(本实验采用辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG),孵育后洗涤,最后显色并测定OD值。本发明的有益效果是1)抗原多肽富含极性氨基酸,易暴露于蛋白表面而成为抗原决定簇,具有极强的特异性;同时,检测过程中血浆的稀释比例可低至1∶1200,灵敏度很高,包被无关蛋白时,OD值与阴性对照相当;2)本发明提供的检测试剂盒采用酶联免疫吸附法测定血浆中的IC53自身抗体,兼具免疫反应的高特异性和酶促反应的高敏感性,不仅检测效率高,而且使用方便,易于临床推广;3)本发明首创发现了IC53基因超表达及其诱发的自身免疫反应(IC53自身抗体)与心力衰竭的相关性,从而为临床上研究、诊断和治疗心力衰竭提供了新的思路,也为开发治疗心力衰竭的药物提供了新的靶点。下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明,并非对本发明的限制,凡依照本发明所述内容进行的任何本领域的等同替换,均属于本发明的保护范围之内。图1,Microarray杂交显示,-His(-)A的ECV304细胞TotalRNA逆转录探针杂交结果,-His(-)A-IC53的ECV304细胞TotalRNA逆转录探针杂交结果。图2验证IC53超表达上调PDGF-B的表达,上图为RNA胶图,下图为Northern杂交结果,,-IC53的ECV340细胞。图3为IC53基因自身抗体水平在正常人及心脏病患者中的分布情况。具体实施例方式实施例1、Microarray分析IC53基因表达与心血管疾病的关系一、IC53真核表达载体构建用下列引物及Pfu经PCR扩增产生一具有XbaI及KpnI酶切位点的片段,经XbaI及KpnI(NEB)-His(-)A载体(中国医学科学院基础医学研究所卢圣栋教授惠赠)切胶回收产物用T4DNA连接酶连接,转化,碱裂解法小提质粒(步骤见下),测序鉴定。上游引物5’-TGGGGCA-3’,下游引物5’-ATCAG-3’)。(一)碱裂解法小提质粒1、(将构建好的载体转化DH5α菌株后,在LB培养基中于37摄氏度摇16小时),4,000rpm×10分钟,弃上清;2、加预冷的溶液I100ul(50mmol/L葡萄糖,25mmol/(pH=),10mmol/LEDTA(pH=)),振荡混匀;3、加溶液II(,1%SDS)200ul,上下颠倒5次,冰置;4、加溶液III(60ml5mol/L++)150ul,上下颠倒数次,冰置5分钟;5、12,000g×10分钟,取上清,转管;6、加一倍体积的酚∶***仿(1∶1),上下颠倒混匀;7、12,000g×10分钟,取上清,转管;8、加无水乙醇1ml,室温置3分钟;9、12,000g×5分钟,弃上清;10、70%乙醇洗一次,12,000g×3分钟,弃上清;11、空气干燥,加含RNase100ng/ml的TE缓冲液25ul;12、37℃消化。(二)转染用质粒提取(按QIAGENPlasmidPurifcationHandbook1999关于QIAfilterTMPlasmidMidKit的提取方法。1、转化重组正确的质粒(测序鉴定)到大肠杆菌DH5α菌株中;2、挑单克隆接种于3mlLB培养基中(氨苄青霉素100ug/ml),37℃,300rpm,8小时;3、按1∶100将其接种于25mlLB培养基中(氨苄100ug/ml),37℃,300rpm,12-16小时;4、收获细菌,4℃,6,000g,15分钟;5、用4ml已加RNaseA的BufferP1重悬细菌,充分混匀;6、加入4mlBufferP2,温和混匀,室温放置5分钟(不能超过5分钟,以防止染色体DNA断裂);7、准备QIAfilterCartridge,将螺帽拧在其下面的管口上,放于一无菌的50ml管中备用;8、加入4ml预冷的BufferP3,温和混匀以裂解细菌,不要置于冰上;9、将裂解混合物加入QIAfilterCartridge中,室温放置10分钟,不要插入活塞;10、加4mlBufferQBT平衡QIAGEN-tip100;11、去掉QIAfilterCartridge下面的螺帽,温和插入活塞,将裂解液滤入平衡好的QIAGEN-tip100中;12、让液体靠重力通过柱子;13、用BfferQC按10ml/次,洗柱子两次;14、用BfferQF5ml洗脱DNA(质粒);15、,混匀,4℃,15,000g,30分钟;16、用2ml室温放置的70%乙醇洗涤沉淀,小心去上清,4℃,15,000g,10分钟;17、室温干燥沉淀(5-10分钟);18、用100ul无菌的TE溶解质粒,测OD定量并跑胶鉴定。(三)稳定转染ECV304细胞(实验室自备,该细胞具有一定的内皮细胞特性)1、ECV304细胞按106cells/ml()接种于6孔板中培养20小时;2、-His(-)A--His(-)A,为SolutionA;3、用100ul无抗的RPMI1640培养基稀释5ulLipofectin,室温20分钟,为SolutionB;4、将SolutionA和B混匀,室温30分钟;5、加入800ul无抗的RPMI1640培养基,混匀后加入用无抗的

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