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一株酿酒酵母菌株及其应用的制作方法.docx


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】的内容,可以使用淘豆网的站内搜索功能,选择自己适合的文档,以下文字是截取该文章内的部分文字,如需要获得完整电子版,请下载此文档到您的设备,方便您编辑和打印。一株酿酒酵母菌株及其应用的制作方法专利名称:一株酿酒酵母菌株及其应用的制作方法技术领域:本发明涉及一株酿酒酵母菌株及其应用。背景技术:酵母菌是一类单细胞真菌的总称,并非系统演化分类的单元。酵母菌是人类文明史中被应用得最早的微生物。目前已知有1000多种酵母菌,根据酵母菌产生孢子(子囊孢子和担孢子)的能力,可将酵母分成三类形成孢子的株系属于子囊菌或担子菌,不形成孢子但主要通过芽殖来繁殖的称为不完全真菌,或者叫“假酵母”(Kreger-vanR,-.[M].herlands=,1984.)。目前已知大部分酵母被分类到子囊菌门。酵母菌在自然界分布广泛,主要生长在偏酸性的潮湿的含糖环境中,例如,在水果、蔬菜、蜜饯的内部和表面以及在果园土壤中最为常见([M],中国轻工业出版社,2005)。酵母营专性或兼性好氧生活,目前未知专性厌氧的酵母。在缺乏氧气时酵母进行无氧呼吸,其中发酵型的酵母可以通过糖酵解途径(EMP途径)将糖类转化成为***酸,***酸再被进一步转化成为二氧化碳和乙醇来获取能量(王镜岩,朱胜庚,(第三版,下册).:82)。在酒精工业上,利用发酵型的酵母无氧呼吸可产乙醇的特点,将酵母可以利用的发酵性糖转化为酒精。乙醇作为可再生能源,可直接作为液体燃料或者同汽油混合使用,燃料乙醇作为新的燃料替代品,可减少对不可再生能源-石油的依赖,保障国家能源的安全。现行酒精工业生产采用较多的是发酵法采用各种含糖(双糖)、淀粉(多糖)的农产品或农林业副产物为原料,经过水解(即糖化)多糖转化为单糖后发酵、或直接发酵双糖转化为乙醇。淀粉质在淀粉酶类的作用下,水解为葡萄糖,再进一步发酵生成乙醇([M].化学工业出版社,2003)。广西地处亚热带地区,非粮经济作物甘蔗和木薯的种植面积和产量皆为全国第一。甘蔗主要用于制糖,糖蜜是甘蔗制糖的副产物,含有大量酵母可发酵性糖。鲜木薯块根的淀粉含量达30%,木薯淀粉经过α-淀粉酶液化和糖化酶糖化后转化为酵母可发酵性糖-葡萄糖。糖蜜和木薯淀粉是酵母发酵产酒精的优良生产原料。2008年,广西中粮生物质能源有限公司已在广西北海建成并投产以糖蜜和木薯为原料年产20万吨燃料乙醇的生产设备。另外,广西还有2家公司较大规模地以糖蜜和木薯为原料生产乙醇,分别为位于钦州市的新天德股份有限公司和位于平果县的平果凯特生物化工股份有限公司。酿酒酵母是酒精工业发酵生产上常用的微生物菌种。酒精工业生产中对菌株的要求越来越高,首先要求酵母菌具有极高的产酒效率,对发酵性糖的转化率高,不造成糖质原料的浪费;其次是发酵液成熟之后酒精含量高,降低蒸馏能耗;再次是发酵速度快,提高设备的利用率,降低生产成本(——燃料酒精[J].ChineseJournalofNature,2007,29(1)30-33)。限制这三大要求的主要因素是酵母对高浓度发酵性糖和酒精的耐受力、对原料的转化率和对各种不利发酵条件(如高温、低PH和有毒物质等)的耐受力。国内酒精工业生产中广泛应用的酿酒酵母为湖北安琪酵母股份公司生产的耐高温活性干酵母(安琪酵母,简称为AQ),虽然发酵特性较好,但也难以满足工业上的更高要求。发明内容本发明的目的是提供一株酿酒酵母菌株及其应用。本发明提供的酿酒酵母(haromycescerevisiae),命名为ZM1-5,简称酿酒酵母ZM1-5或ZM1-5,分离自广西壮族自治区钦州市果园土壤,已于2010年4月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(,地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号),。酿酒酵母ZM1-5可用于生产酒精。用于生产酒精时,酿酒酵母ZM1-5可以单独使用,也可与其它酿酒酵母混合使用。应用所述酿酒酵母ZM1-5生产酒精时,pH值为3-9,温度为28-42°C。应用所述酿酒酵母ZM1-5生产酒精时,pH值优选为4-5。应用所述酿酒酵母ZM1-5生产酒精时,温度优选为28-40°C,温度最优选为32°C。本发明还保护一种生产酒精的方法,是通过发酵酿酒酵母ZM1-5,得到酒精。所述方法中,用于发酵的底物具体可为葡萄糖和/或蔗糖。所述方法中,用于发酵的底物可为木薯产品(如木薯粉液化醪)、糖蜜和甘蔗汁中的至少一种。所述发酵的温度可为32°C至42°C中的任一温度,如32°C、37°C、40°C或42°C。所述发酵起始时,所述酿酒酵母ZM1-,--,、/mL。酿酒酵母ZM1-5具有以下生理特征(1)在酵母粉蛋白胨琼脂平板上32°C培养2-3天,菌落为乳白色、隆起、表面光滑、边缘整齐;细胞圆形或椭圆形,无性繁殖方式为芽殖;(2)菌株最适生长和发酵温度32°C;pH范围3-9;最适生长pH4_5;(3)该菌株在32°C、37°C和42°C的生长速率快于安琪酵母;(4)该菌株能在50%的葡萄糖培养基上生长;(1、16%乙醇、48/1乙酸、20(^8/1^418的¥0培养基上生长;(5)应用于以木薯粉液化醪、糖蜜和甘蔗汁为原料发酵生产酒精时,酒精产量和发酵效率比目前工业生产用安琪耐高温活性干酵母高。与现有工业生产常用的安琪耐高温酵母菌比较,酵母菌株ZM1-5具有生长快、酒精产量高、耐高温、耐高糖、耐高浓度乙醇和耐酸等多个优点。酿酒酵母ZM1-5可应用于以木薯粉、糖蜜和甘蔗汁等为原料的浓醪发酵产酒精工艺(同步糖化发酵)中,解决工业生产中酵母菌不能耐受高渗透压、高浓度乙醇和发酵后期效率低等问题,降低酒精工业生产的成本。与安琪耐高温酵母菌相比,酿酒酵母ZM1-5在高温条件下发酵具有更高的酒精产量。酵母菌株ZM1-5用于同步糖化发酵产酒精工艺中,有望解决浓醪发酵中底物浓度高(渗透压高)、发酵罐内温度高、发酵后期酵母菌受高浓度酒精抑制等问题。图1为ZM1-5和AQ在各种高温条件下在YPD平板上的照片。图2为30°C时ZM1-5和AQ在各种浓度NaCl的YPD平板上的照片。图3为30°C时ZM1-5和AQ在各种浓度乙醇的YPD平板上的照片。图4为30°C时ZM1-5和AQ在各种浓度乙酸的YPD平板上的照片。图5为30°C时ZM1-5和AQ在各种浓度G418的YPD平板上的照片。图6为30°C时ZM1-5和AQ在50%葡萄糖的YPD平板上的照片。图7为ZM1-5和AQ在不同培养温度下在YPD平板上的形态;A=AQ在32°C的菌落形态;B:ΖΜ1-5在32°C的菌落形态;C:AQ在37°C的菌落形态;D:ZM1_5在37°C的菌落形态;E=AQ在42°C的菌落形态;F:ΖΜ1-5在42°C的菌落形态。图8为ZM1-5和AQ在电子扫描显微镜下的形态;A=AQ在32°C培养时细胞的显微形态;B:ΖΜ1-5在32°C培养时细胞的显微形态;C=AQ在42°C培养时细胞的显微形态;DZM1-5在42°C培养时细胞的显微形态。图9为ZM1-5与AQ在不同pH条件下生长24h的菌体量比较。图10为ZM1-5与AQ在不同温度条件下生长20h的菌体量比较。图11为ZM1-5与AQ在不同温度条件下的生长曲线比较;A=AQ;B:ZM1_5。图12为ZM1-5与AQ在不同温度下发酵葡萄糖72h后的酒份比较。图13为ZM1-5与AQ在不同温度下发酵蔗糖72h后的酒份比较。图14为ZM1-5与AQ发酵木薯粉液化醪结果分析;A酒份;B活菌浓度;C残总糖;D残还原糖。图15为ZM1-5与AQ发酵甘蔗汁产物结果分析;A酒份(灭菌甘蔗汁为底物);B酒份(新鲜甘蔗汁为底物);C残糖含量(灭菌甘蔗汁为底物);D残糖含量(新鲜甘蔗汁为底物);E=CO2失重(灭菌甘蔗汁为底物);F=CO2失重(新鲜甘蔗汁为底物)。图16为ZM1-5与AQ在不同温度下发酵甘蔗糖蜜结果分析;A酒份;B=CO2失重。具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明,但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料,如无特殊说明,均为自常规生化试剂商店购买得到的。安琪酵母(AQ,耐高温活性干酵母)购自湖北安琪酵母股份公司。下述实施例中的%,如无特殊说明,均为质量百分含量。YPD培养基()酵母提取物10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L,固体培养基含琼脂15g/L。YPD+50%Glu培养基(ρΗ4·5)固体培养基含琼脂15g/L。YPD+20%Glu培养基(ρΗ4·5)固体培养基含琼脂15g/L。YPD+20%Sue培养基(ρΗ4·5)体培养基含琼脂15g/L。实施例1、酵母菌株ZM1-5的获得酵母提取物10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖500g/L,酵母提取物10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖200g/L,酵母提取物10g/L、蛋白胨20g/L、蔗糖200g/L,固一、酵母菌株ZM1-5的获得1、样本采集样品果园土壤。采集地点广西壮族自治区钦州市农村。2、酵母菌株的分离采用稀释涂平板法进行分离称取Ig土壤于IOOmL三角瓶中,加入IOmL灭菌蒸馏水,置于28°C、转速为ISOrpm的恒温摇床震荡2小时,取ImL悬浊液稀释至10入10_2、10_3、10_4、10_5稀释度,各稀释梯度分别取100μL涂布YPD平板,置于32°C恒温培养箱培养2天后挑出单菌落。3、酵母菌株的筛选酵母菌的具体筛选步骤如下①观察平板上长出的菌落形态,并镜检其细胞形态,对其中确定为酵母菌的菌落进行纯化,纯化后作为备选菌株进行菌株耐高温生长试验;②纯化后的菌株分别置于32°C、37°C、42°C培养3_5天,观察菌体生长情况,选出耐高温酵母菌株。③各耐高温酵母菌株分别点接于YPD培养基上,32°C培养48小时,长出菌落后倒入TTC上层培养基(,,,水IOOmL),避光保温2-3h,选出显色较深的酵母菌株。④TTC筛选得到的酵母菌株分别接入YPD液体培养基中,28。C、ISOrpm摇床过夜培养,菌液按OD6tltl=,分别置于32°C、37°C、40°C、42°C下培养,分别在12h、24h和48h观察和记录杜氏小管中产气情况,选出产气较多的酵母菌株。⑤杜氏发酵检测产气快且多的菌株接入50mLYPD液体培养基,28°C、ISOrpm摇床培养24h,按10%的接种量(体积百分含量)接入装有IOOmL含YPD+20%Glu液体培养基的250mL三角瓶,发酵72h后蒸馏检测其酒精产量。⑥酵母菌在各种培养基上的抗逆性生长检测采用休止细胞梯度生长实验,将酵母菌接种于20mL的YPD液体培养基中,320C培养12h(OD600=),离心收集菌体,制备休止细胞。调节菌液浓度为0D_=,并稀释至IOciUO-1UO-2UO-3UO-4的浓度,分别取4μ1点接于各种高渗透压培养基[YPD+NaCl(,,),YPD+50%Glu]平板,以及YPD+乙醇(12%,14%,16%),YPD+乙酸(3g/L,4g/L),YPD+G418(100μg/L,200μg/L)平板,经32°C培养2-3天,观察菌落生长情况。本段中的%均为体积百分含量。通过以上分离和筛选,得到33株酵母菌,其中一株各方面性状良好,将其命名为菌株ZM1-5。ZM1-5和AQ在各种高温条件下在YPD平板上的照片见图1。30°C时ZM1-5和AQ在各种浓度NaCl条件下在YPD平板上的照片见图2。30°C时ZM1-5和AQ在各种浓度乙醇条件下在YPD平板上的照片见图3。30°C时ZM1-5和AQ在各种浓度乙酸条件下在YPD平板上的照片见图4。30°C时ZM1-5和AQ在各种浓度G418条件下在YPD平板上的照片见图5。30°C时ZM1-5和AQ在50%葡萄糖条件下在YPD平板上的照片见图6。二、酿酒酵母ZM1-5的鉴定ZM1-5分别在YPD平板上32°C、37°C、42°C培养2天,32°C、37°C生长旺盛,42°C也能生长。菌落为乳白色、隆起、表面光滑、边缘整齐(见图7)。显微镜下细胞圆形或椭圆形,无性繁殖方式为多边芽殖(见图8)。ZM1-5可同化果糖、棉子糖、半乳糖、麦芽糖、纤维二糖、蜜二糖、海藻糖、松三糖、α-***D葡萄糖苷、N-乙酰葡萄糖***;ΖΜ1-5可同化硫酸铵、***钾;ΖΜ1-5可发酵葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、半乳糖,不可发酵乳糖。根据ΖΜ1-5的形态与生理生化特征,参考《TheYeast))和《常见与常用真菌》,将ZM1-5鉴定为酿酒酵母(haromycescerevisiae)。将酿酒酵母ZM1-5保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,。实施例2、酿酒酵母ZM1-5与安琪酵母AQ的最适生长pH值的比较酿酒酵母ZM1-5与安琪酵母AQ采用完全相同的条件进行处理,确定最适生长pH值。1、将酵母菌(酿酒酵母ZM1-5或安琪酵母AQ)过夜培养,检测菌液的0D_值。2、按OD6tltl=(3、4、5、6、7、8或9)的YPD液体培养基中,28°C、ISOrpm培养24小时,用分光光度计于600nm波长下测定光密度值(0D_值)。设置三次重复试验,结果取平均值。ZM1-5与AQ生长24h的菌体量比较见图9。酿酒酵母ZM1-5与安琪酵母AQ的最适生长pH均为4-5。实施例3、酿酒酵母ZM1-5与安琪酵母AQ的最适生长温度的比较酿酒酵母ZM1-5与安琪酵母AQ采用完全相同的条件进行处理,确定最适生长温度。1、将酵母菌(酿酒酵母ZM1-5或安琪酵母AQ)过夜培养,检测菌液的0D_值。2、按OD6tltl=()中,不同温度(28°C、32°C、35°C、37°C、40°C或42°C)、180rpm培养20小时,检测菌液的OD600值。设置三次重复试验,结果取平均值。ZM1-5与AQ在不同温度条件下生长20h的菌体量比较见图10。酿酒酵母ZM1-5与安琪酵母AQ的最适生长温度均为32°C,酿酒酵母ZM1-5在28-42°C温度下生长量均比安琪酵母AQ高。实施例4、酿酒酵母ZM1-5与安琪酵母AQ在不同温度下生长曲线的比较酿酒酵母ZM1-5与安琪酵母AQ采用完全相同的条件进行处理,比较不同温度下的生长曲线。1、将酵母菌(酿酒酵母ZM1-5或安琪酵母AQ)过夜培养,检测菌液的0D_值。2、按0D_=()中,分别不同温度(281、321、351、371、401或42°0、180卬111培养72

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