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一株枯草芽孢杆菌及其在生物催化法生产(r)-扁桃酸中的应用的制作方法.docx


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】的内容,可以使用淘豆网的站内搜索功能,选择自己适合的文档,以下文字是截取该文章内的部分文字,如需要获得完整电子版,请下载此文档到您的设备,方便您编辑和打印。一株枯草芽孢杆菌及其在生物催化法生产(r)-扁桃酸中的应用的制作方法专利名称::一株枯草芽孢杆菌及其在生物催化法生产(r)-扁桃酸中的应用的制作方法技术领域::本发明属于生物化工领域,涉及一株新菌株一枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)KR2,以及该菌株在生物催化法生产(R)-扁桃酸中的应用。背景技术::(R)-扁桃酸又称α-羟基***、苯乙醇酸、苦杏仁酸,易溶于***、异丙醇,溶于乙醇和水。该化合物是一种重要的手性药物中间体,被广泛应用于多种光学活性药物的合成,如半合成青霉素和头孢霉素等抗生素,减肥药物,抗肿瘤药物,农药以及其他药物。目前国际市场需求约以年均10%左右增长,市场潜力巨大。扁桃***又称苯乙醇***、马来***等,浅黄色透明油状液体,溶于乙醇、***、***仿,几乎不溶于水。将苯甲醛溶于***仿中,加入无水氢***酸可简单反应制得扁桃***,再经过化学法或生物催化法水解得扁桃酸。其中以化学水解法三废量大,水污染严重,收率低,产品以外消旋扁桃酸形式存在于反应中,需进行复杂的拆分。生物催化法可采用高度立体选择性的***水解酶将外消旋的扁桃***一步水解制得具有光学活性的扁桃酸异构体。除此之外,目前已具备的(R)-扁桃酸的制备方法主要有色谱法、化学拆分法和生物催化法。色谱法具有快速,产品纯度高和方法简便等特点,但需要昂贵的手性柱等设备,处理量小,成本高,不适合规模化生产。化学拆分法主要是采用手性拆分剂与扁桃酸两种对映体形成非对映体盐,以增加其物理性质的差异以便结晶分离。该法具有规模化生产的应用潜力,但表现出产率低、产物的光学纯度不高、拆分试剂较贵、对环境污染大等局限。生物催化法主要是利用生物体内相关酶对底物的高度立体选择性进行催化转化反应,产物光学纯度高,收率高,副反应少,可在常温常压下进行,安全环保。根据底物和催化剂(生物酶)种类不同又可以有多种路线选择,1715398A中均以外消旋的扁桃酸为底物,利用特定微生物对外消旋扁桃酸中两个对映异构体降解速度的不同实现拆分。该方法的不足之处在于以降解其中某一对映体的方式来获得另一种具有光学活性的扁桃酸,其最终产率不高于50%,1710087Α中均报道了采用苯甲酰甲酸或其衍生物作为底物,分别采用不同的微生物进行拆分得到单一构型的手性扁桃酸。但苯甲酰甲酸属α-***酸,容易氧化,脱羧,脱***基,取制比较困难,价格较贵,以此作为扁桃酸工业化生产原料成本相对较高。发明内容本发明的目的在于针对以上现有技术的不足,提供一株新的芽孢杆菌(Bacillussubtilis)KR2();本发明的另一目的是提供该细菌在非水相系统中以扁桃***为底物,生物催化生产(R)-扁桃酸中的应用。本发明以扁桃***为底物,采用非水相系统进行生物催化反应,旨在解决现有技术中以扁桃***为底物生物催化产(R)-扁桃酸中产物收率低,底物和产物分离难等关键制约技术难题,借助原料的成本优势为规模化生产高纯度(R)-扁桃酸提供一条可行的途径。本发明的目的可以通过以下措施达到枯草芽孢杆菌KR2(),灰白色,不透明,表面湿润,边缘光滑,整个菌落凸起,易挑取;镜检成杆状,大小长为()X(),芽孢中生。°C下培养4896小时后的培养特征见表1。表1枯草芽孢杆菌KR2()()生理生化特征tableseeoriginaldocumentpage5(注表中“+”表示阳性,“-”表示阴性。)枯草芽孢杆菌KR2()的培养先进行枯草芽孢杆菌KR2()斜面种子制备,将枯草芽孢杆菌KR2()接种到灭过菌的斜面后在2035°C下培养37天,刮取35环菌种接种到装有已灭菌的液体培养基的三角瓶中,在温度为2035°C,转速为100300rpm下振荡培养30120小时,即可作为枯草芽孢杆菌KR2()一级种子。同样培养条件下,将一级种子按310%(%:v/v)的接种量转接第二批装有同样培养基的三角瓶中,同样条件下培养3072小时后作为枯草芽孢杆菌KR2()二级种子。将枯草芽孢杆菌KR2()二级种子以310%(%:v/v)的接种量接种到7300L发酵罐中进行发酵培养,培养条件为装液量6070%:v/v),(v/),,温度:2035°C,转速100400rpm,发酵时间30120小时。发酵结束后将发酵罐内的发酵液3000rpm离心lOmin,弃上清,所得沉淀用去离子水重悬后3000rpm离心lOmin,弃上清,得枯草芽孢杆菌KR2()湿菌体。所涉及的培养基成分如下斜面培养基(g/L)葡萄糖1030,酵母膏210,蛋白胨210,***化钠15,,,,琼脂1030,pH:59。一级、二级液体种子培养基(g/L):葡萄糖1030,酵母膏210,蛋白胨210,***化钠15,,,,己内酰***,异戊***0·15,***化钴550ppm,pH59。发酵培养基(g/L)葡萄糖1050,酵母膏210,蛋白胨210,***化钠15,,,,己内酰***,异戊***0·15,***化钴550ppm,pH:59。枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)KR2()在生物催化法合成(R)-扁桃酸中的应用。一种利用枯草芽孢杆菌KR2()在非水相系统中生物催化法生产(R)-扁桃酸的方法。该方法的工艺流程见图1。该方法的具体步骤为(1)生物催化剂的制备将枯草芽孢杆菌KR2()湿菌体与共价修饰剂以11150的质量比混合均勻,此混合液即可作为本发明的生物催化剂。所述的共价修饰剂选用分子量彡700的聚乙二醇,所述的枯草芽孢杆菌KR2()湿菌体与共价修饰剂以1115的质量比混合均勻。(2)非水相催化反应将制备好的生物催化剂以装液量体积的515%加入到装有有机溶剂的搅拌釜中,有机溶剂的加入量为搅拌釜体积的5070%(ν/ν),扁桃***的添加量为装液量的110%(g/100mL)。在温度为1535°C,搅拌转速为100400rpm下将扁桃***催化水解为扁桃酸。当底物浓度趋向于零时即可结束反应。其中所述的有机溶剂选自乙酸乙酯、二***甲烷、甲苯、异丙基醚、***异丁***、正丁醇、异丙醇中的任意一种,优选乙酸乙酯。所述的催化剂除步骤(1)中所制备的经共价修饰的枯草芽孢杆菌KR2()细胞外,还可以是枯草芽孢杆菌KR2()的游离细胞、固定化细胞颗粒或絮凝细胞液,优选经共价修饰的枯草芽孢杆菌KR2()细胞。(3)产物分离将超滤膜系统过滤出的反应液在7585°C蒸馏浓缩,水洗后04°C结晶便得扁桃酸。蒸馏和水洗出的有机相均可继续套用到下批催化反应中去。本发明的有益效果本发明主要利用枯草芽孢杆菌KR2()体内酶的催化作用在非水相系统中将扁桃***水解成(R)-扁桃酸。该枯草芽孢杆菌KR2()对有机溶剂的耐受性强,克服了普通微生物细胞在有机溶剂系统中生物酶易失活、酶活低等不足,同时对底物表现出较好的立体选择性。所得(R)-扁桃酸的光学纯度达95%,(R)-扁桃酸的产率达70%以上。反应液经过浓缩,水洗后,产物(R)-扁桃酸较好的溶解到水相中,残留的底物扁桃***几乎不溶于水相,可以随有机相套用到下一批反应中,不仅实现了底物与产物较好的分离,而且间接的提高了底物利用率。涉及的生物材料样品的保藏本发明所要求保护的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)KR2保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,地址为北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所,,保藏日期为2009年8月19日。图1枯草芽孢杆菌KR2()在非水相系统中生物催化法生产(R)-扁桃酸的工艺流程图。具体实施例方式实施例1菌种筛选本发明所涉及的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)KR2()是本公司生物化工研究组成员从受***类化合物污染达15年以上的的农药厂土壤中筛选得到。本发明中菌种的筛选方法如下从南京第一农药厂污水池不同角度取污泥样100余批,分批富集培养后进行筛选和鉴定称取IOg污泥,加无菌水50mL,用玻璃珠摇碎后取5mL悬浊液接种到45mL富集培养基中,放置30°C摇床上,120rpm振荡培养3天。之后取该培养液进行梯度稀释,取10_6、IO-7UO-8的梯度稀释液涂布到含初筛固体培养基的平板上,置30°C恒温培养箱培养36天。挑取生长出的单菌落接种到新的初筛固体培养基上扩大培养,培养条件同上。待菌长出后刮去35环接种到液体发酵培养基中进行培养。在30°C摇床上120rpm下振荡培养3天,取15mL培养液3000rpm下离心lOmin,倒去上清液后用等体积的生理盐水冲洗沉淀菌体,继续离心得菌体。将所得菌体添加到含(%:g/100mL)亚氨基二乙***的PBS缓冲液中转化2小时,。取5mL转化液3000rpm下离心IOmin得上清液,HPLC法分析上清液。如果转化液含有亚氨基二乙酸则说明该菌对亚氨基二乙***具有转化能力,选择其中亚氨基二乙酸转化率最高的一株,按《简明伯杰细菌鉴定手册》第八版进行鉴定为枯草芽孢杆菌。将该株枯草芽孢杆菌命名为KR2,保藏于中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心(),,保藏日期为2009年8月19日。本发明中的枯草芽孢杆菌KR2()能同时在分别以丙烯***、烟***、乳***、羟基乙***,亚氨基二乙***为唯一氮源的固体初筛培养基上生长,底物范围广,降解***类化合物能力强,适合用作本发明中亚氨基二乙酸的生产应用。筛选方法中的所述的液体富集培养基、固体初筛培养基、液体复筛培养基分别如下富集培养基(g/100mL)葡萄糖:3,,,***,,,,?!1:7,1211灭菌20111土11。固体初筛培养基(g/100mL)葡萄糖3,亚氨基二乙***(或丙烯***、或烟***、或乳***、或羟基乙***):1,***,,,,琼脂2,pH-J,121°C灭菌20min。液体发酵培养基(g/100mL)葡萄糖3,,,***,,,,尿素:,?!1:7,1211灭菌20min。实施例2枯草芽孢杆菌KR2()生物催化剂的制备在无菌超净工作台内用接种环刮取枯草芽孢杆菌KR2()斜面菌种3环,接种到一级液体种子培养基中(葡萄糖15,酵母膏5,蛋白胨5,***化钠2,磷酸二氢钾1,磷酸氢二钾1,,己内酰***5,异戊***1,***化钴10ppm,pH:,单位g/L)。在温度为25°C,转速为150rpm下振荡培养48小时即可得一级枯草芽孢杆菌KR2()种子液,将该一级种子液按照10%的接种量转接到装有同样成分已灭菌的培养基中继续进行培养,48小时后可得枯草芽孢杆菌KR2()二级种子液。将枯草芽孢杆菌KR2()二级种子液按照10%的接种量接种到35L已灭菌的液体发酵培养基中,(葡萄糖30,酵母膏10,蛋白胨10,***化钠2,磷酸二氢钾1,磷酸氢二钾1,,异戊***1,己内酰***5,***化钴10ppm,pH:7,单位g/L),发酵罐体积为50L,采用通空气与搅拌联用的方式控制溶氧不低于10%,,,温度25°C,起始转速lOOrpm,发酵过程中根据发酵液的溶氧水平有步骤的调节,最大转速不超过400rpm,发酵72小时后即可制得枯草芽孢杆菌KR2()细胞发酵液。该发酵液3000rpm离心IOmin得沉淀细胞,用去离子水重悬后继续3000rpm离心lOmin,弃上清得沉淀湿菌体。将枯草芽孢杆菌KR2()湿菌体与聚乙二醇(分子量为200)以13的质量比混合均勻,此混合液即可作为本发明的生物催化剂。实施例3酶活检测本实施例采用枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)。酶活的定义在25°C下,1克湿菌体与1毫升扁桃***催化反应1小时后生成的扁桃酸的微克数,该微克数即为总酶活力单位数。扁桃酸的检测采用HPLC法,检测参数为色谱柱1^(>00-3,5-0肌6手性柱,15011111^、流动相异丙醇/水(30/70)、、柱温25°C、检测UV230nm。在本发明条件下,每毫升发酵液中生物量最高可达47mg湿菌体,总酶活最高可达985U。实施例4非水相催化反应在50L搅拌釜内,装有35L乙酸乙酯,***,平均分2次加入,。在温度为25°C,搅拌转速为150rpm下催化反应,每小时测定一次底物浓度,检测到扁桃***的浓度趋向于零时结束反应。,之后在80°C下蒸馏浓缩得粗产物,同时回收溶剂进行套用。将得到的粗产物用5倍体积的去离子水进行水洗,残留的不溶性有机相套用到下批次反应釜中。将水相在4°C下冷冻结晶,剩余的液体蒸发水分继续结晶,%(R)-,%。实施例6本实施例仅改变催化剂的添加量,其余反应条件,底物添加量和产物分离过程完全与实施例4、实施例5—致。单独进行两批反应,反应釜中生物催化剂的添加量分别为2L和5L。最后分别在52小时和27小时后检测反应液中扁桃***的含量基本为零,停止反应后进行产物分离。%(R)%%(R)-,%0实施例7本实施例仅改变反应釜中底物扁桃***的添加量,其余反应条件,催化剂添加量和产物分离过程完全与实施例4、例5—致。本实施例中扁桃***的累积添加量为3kg,分3次加入,每次添加量为lkg。%(R)-,%。实施例8本实施例仅改变催化反应的温度,其余反应条件,底物添加量和产物分离过程完全与实施例

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