黑素细胞生物活性检测及个体化培养方法.docx

该【黑素细胞生物活性检测及个体化培养方法 】是由【开心果】上传分享，文档一共【10】页，该文档可以免费在线阅读，需要了解更多关于【黑素细胞生物活性检测及个体化培养方法 】的内容，可以使用淘豆网的站内搜索功能，选择自己适合的文档，以下文字是截取该文章内的部分文字，如需要获得完整电子版，请下载此文档到您的设备，方便您编辑和打印。黑素细胞生物活性检测及个体化培养方法专利名称:黑素细胞生物活性检测及个体化培养方法技术领域:本发明提供了一种黑素细胞生物活性检测方法及个体化培养方法。背景技术:随着黑素细胞培养技术的日益成熟,使用培养的自体黑素细胞移植成为目前白癜风治疗的研究和发展方向之一。移植的纯黑素细胞能为白癜风区域提供新的黑素细胞来源,通过增殖扩散,使白斑区复色。用培养的黑素细胞作移植最大技术难点在于黑素细胞生长较差,无法在短期内大量扩增。移植的黑素细胞生物学活性对疗效有着极其重要的作用,挑选选生物学活性好的黑素细胞进行移植可明显提高疗效,目前还没有对移植的自体黑素细胞生物学活性进行检测的研究报道。发明内容本发明目的是提供一种黑素细胞生物活性检测方法及利用该检测方法对黑素细胞个体化培养的方法。本发明采用的技术方案是黑素细胞生物活性检测方法,所述方法包括取分离自白癜风患者表皮细胞的黑素细胞,进行传代培养,传代培养过程中进行下述参数评测(1)黑素细胞分裂时间DOT计算每次接种和传代时计数黑素细胞数量,计算获得传代时细胞生长倍数P,根据细胞生长倍数P和生长时间T,按公式计算细胞黑素分裂时间DOT=,单位为日;(2)黑素含量M计算用二***亚砜溶解已知浓度的黑色素,在分光度计475nm处测吸光度Atl,以黑色素含量为横坐标、以对应吸光度值为纵坐标制作标准曲线;在黑素细胞接种和传代时,收集定量黑素细胞离心,加入lmol/1NaOH在37°C水浴溶解细胞30分钟后,在分光度计475nm处测细胞吸光度A,根据标准曲线计算获得每个细胞的黑素含量M,单位ng/cell;(3)黑素制造量MP计算=MP=(M2XP-M1VlJD(P-I),其中MP为黑素细胞制造量,单位ng/Cell/24hr为接种时细胞黑素含量,单位ng/cell;M2为传代时细胞黑素含量,单位ng/cell;P为细胞增长倍数;D为细胞分裂时间DOT,单位日;(4),M值降低(,M值升高(M>),细胞的树突无变化,则从其下一代起将Hul6培养基中bFGF浓度增加到4080ng/ml进行传代培养;3)、若某一代传代细胞的DOT值>,且伴有细胞树突减少(具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述,但本发明的保护范围并不仅限于此实施例1一、材料与方法(1)病例10例白癜风患者为2009年6月至2009年9月杭州市第三人民医院皮肤科白癜风专病门诊患者,均符合中国中西医结合学会皮肤性病专业委员会色素病学组制定的诊断标准((2003年修订稿)[J].中华皮肤科杂志,2004,37(7)440.);病期参照VIDA评分标准(NjooMD,DasPK,BosJD,,1999,135(4):407_413.),均为稳定期节段型白癜风患者,病情稳定时间均在6个月以上。所有患者均经知情同意,试验方案经医院伦理委员会讨论通过。(2)试剂和仪器F12基础培养基、胎牛血清、谷***酰氨、庆大霉素、%胰酶、%EDTA、%胰酶-EDTA、D-Hank's液、基因素均购自GIBCO公司,霍乱***(CT)、IBMX购自SIGMA公司,人重组碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)购自P印ro-Tech公司。倒置显微镜和立体显微镜为0LYMPAS产品。(3)(负压40kPa,时间6090分钟),,用虹膜剪沿水疱壁边缘剪下疱壁,置于无菌D-Hank's液中。%%EDTA先后在37°C消化10分钟。在立体显微镜下剥下角质层,刮下角质层下及真皮上的细胞。用D-Hank's液冲洗后1000r/min离心5分钟,收集沉淀细胞重悬浮于培养基中。(以F12基础培养基为基质,含bFGF25ng/ml、CT10ng/ml、IBMX20ug/ml和10%胎牛血清)将细胞团吹打成细胞悬液,调整细胞浓度5X105/mL接种于培养瓶中,置37°C,5%CO2培养箱内培养。在第三天加入基因素以去除角质形成细胞和成纤维细胞的污染,隔天换液1次。当黑素细胞融合后,%胰酶-EDTA将黑素细胞从培养瓶上消化下来进行传代培养。(DOT)计算每次接种和传代时均计数黑素细胞数量,计算获得传代时细胞生长倍数P,根据细胞生长倍数(P)和生长时间(T),按照公式计算黑素细胞分裂时间(DOT),DOT=。(M)计算用DMSO溶解已知浓度的黑色素,在分光光度计475nm处测吸光度(A),以黑色素含量为横坐标、以对应吸光度值为纵坐标制作标准曲线。在黑素细胞接种和传代时,收集一定数量的黑素细胞离心,加入Imol/LNaOH在37°C水浴箱溶解细胞30分钟,在分光光度计475nm处测吸光度(A),在标准曲线上查找和计算每个细胞的黑素含量(M)。=MP=(M2XP-(P-I)。MP黑素细胞制造量(ng/cell/24hr)M1接种时细胞黑素含量(ng/cell)M2传代时细胞黑素含量(ng/cell)P细胞增长倍数D细胞分裂时间(D0T,日)①培养过程中发现黑素细胞生长速度缓慢(DOT>),每个细胞黑素含量降低(),每个细胞黑素含量升高(M>),细胞的树突无变化,则提高bFGF浓度至4080ng/ml。③细胞DOT值大(DOT>)且伴有细胞树突减少(,且伴有细胞树突减少(),细胞黑素含量降低(,细胞黑素含量升高(M>),从第三代起提高bFGF浓度到60ng/ml。病例8细胞DOT值>,细胞黑素含量升高(M>),从第三代起提高bFGF浓度到60ng/ml。(4)个体化培养细胞数量及形态观察接种时细胞的数量和形态相似;培养2天后个体化培养细胞的数量较常规培养增多,细胞树突也有所增加;培养5天后个体化培养细胞的数量较常规培养明显增多,细胞树突也明显增加(见图1)。三、;病例1、2、3、,第三代到第六代细胞的DOT明显增大;病例4、5、6、7、9、,;。病例1、2、3、8第二代到第六代黑素细胞M均较大,数值不稳定;病例4、5、6、7、9、,且每例患者的第二代到第六代的M数值稳定;10例患者第七代细胞的M均明显增大。。以上结果表明病例4、5、6、7、9、10第一代至第六代的黑素细胞和病例1、2、3、8第一代的黑素细胞生长均处于开始或生长阶段,可进行自体黑素细胞移植;病例1、2、3、8第二代至第七代的黑素细胞和病例4、5、6、7、9、10第七代的黑素细胞生长均有明显衰老现象,此类细胞不易进行自体黑素细胞移植。根据细胞生长快慢(DOT值)、细胞突及黑素量可以判断缺乏的因素,在此基础上对病例1、2、3、8第二代黑素细胞制定了不同补充方案,进行个体化矫正。个体化培养后细胞的数量明显增多,细胞的树突也明显增加。个体化矫正后病例1、2、3、8第三代到第六代细胞的DOT均明显减小(),且M和MP数值稳定,细胞的生长为开始和生长阶段,这类细胞可以进行自体黑素细胞移植。但进行个体化矫正后第七代的黑素细胞DOT均较大(),细胞明显衰老,不易进行细胞移植。研究发现稳定期白癜风患者生物学活性好的六代以内的黑素细胞和生物学活性不好的六代以内的黑素细胞在经过个体化矫正后,均可用于临床移植治疗;但第七代的白癜风患者黑素细胞,不管是否经过个体化矫正,都不易进行细胞移植。表1:10例白癜风患者黑素细胞的生物学活性病例第--,0494,,,,,0513,,,,,,,,,,096注D0T细胞分裂时间(天);M每个细胞黑素含量(ng/cell);MP每个细胞24小时黑素制造量(ng/cell/24hr)。表2常规培养和个体化培养黑素细胞生物学活性的比较病-,,,,,(天);M每个细胞黑素含量(ng/cell);MP每个细胞24小时黑素制造量(ng/cell/24hr)。*常规培养Δ个体化培养。权利要求黑素细胞生物活性检测方法,所述方法包括取分离自白癜风患者表皮细胞的黑素细胞,进行传代培养,传代培养过程中进行下述参数评测(1)黑素细胞分裂时间DOT计算每次接种和传代时计数黑素细胞数量,计算获得传代时细胞生长倍数P,根据细胞生长倍数P和生长时间T,按公式计算细胞黑素分裂时间DOT=,单位为日;(2)黑素含量M计算用二***亚砜溶解已知浓度的黑色素,在分光度计475nm处测吸光度A0,以黑色素含量为横坐标、以对应吸光度值为纵坐标制作标准曲线;在黑素细胞接种和传代时,收集定量黑素细胞离心,加入1mol/lNaOH在37℃水浴溶解细胞30分钟后,在分光度计475nm处测细胞吸光度A,根据标准曲线计算获得每个细胞的黑素含量M,单位ng/cell;(3)黑素制造量MP计算MP=(M2×PM1)/(P1),其中MP为黑素细胞制造量,单位ng/cell/24hr;M1为接种时细胞黑素含量,单位ng/cell;M2为传代时细胞黑素含量,单位ng/cell;P为细胞增长倍数;D为细胞分裂时间DOT,单位日;(4)结果判断若传代细胞的DOT值<,且M、<M<,MP<,则判定该传代细胞处于开始或生长阶段,适宜进行自体黑素细胞移植。,所述方法包括(一)取分离自白癜风患者表皮细胞的黑素细胞,于Hul6培养基中进行传代培养,传代培养过程中进行下述参数评测(1)黑素细胞分裂时间DOT计算每次接种和传代时计数黑素细胞数量,计算获得传代时细胞生长倍数P,根据细胞生长倍数P和生长时间T,按公式计算细胞黑素分裂时间DOT=,单位为日;(2)黑素含量M计算用二***亚砜溶解已知浓度的黑色素,在分光度计475nm处测吸光度Atl,以黑色素含量为横坐标、以对应吸光度值为纵坐标制作标准曲线;在黑素细胞接种和传代时,收集定量黑素细胞离心,加入lmol/1NaOH在37°C水浴溶解细胞30分钟后,在分光度计475nm处测细胞吸光度A,根据标准曲线计算获得每个细胞的黑素含量M,单位ng/cell;(3)黑素制造量MP计算=MP=(M2XP-M1VlJD(P-I),其中MP为黑素细胞制造量,单位ng/cell/24hr为接种时细胞黑素含量,单位ng/cell;M2为传代时细胞黑素含量,单位ng/cell;P为细胞增长倍数;D为细胞分裂时间D0T,单位日;所述Hul6培养基终浓度组成如下bFGF25ng/ml,CT10ng/ml,IBMX20ug/ml,胎牛血清10%,溶剂为F12基础培养基;(二)根据传代细胞各参数评测结果,对培养基组分进行调整1)、若传代细胞的DOT值>,,M值升高至M>,细胞的树突无变化,则将Hul6培养基中bFGF浓度增加到4080ng/ml;3)、若传代细胞的DOT值>,且细胞的树突减少至全文摘要本发明提供了一种黑素细胞生物活性检测方法及个体化培养方法。本发明采用HU16选择性培养基在体外成功培养了白癜风患者的移植所需足量的黑素细胞,建立了黑素细胞细胞分裂时间(DOT)、黑素含量(M)和黑素制造量(MP)的检测方法;同时建立了黑素细胞个体化培养实验方案,效果明显。本发明为自体黑素细胞移植治疗白癜风筛选生物学活性好的黑素细胞提供了实用可靠的实验依据,并对生长不好黑素细胞进行个体化矫正后再进行细胞移植提供了较好的实验方案。