高表达发酵单胞菌属启动子的制作方法.docx

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】的内容，可以使用淘豆网的站内搜索功能，选择自己适合的文档，以下文字是截取该文章内的部分文字，如需要获得完整电子版，请下载此文档到您的设备，方便您编辑和打印。高表达发酵单胞菌属启动子的制作方法专利名称:高表达发酵单胞菌属启动子的制作方法技术领域:本发明涉及微生物学和基因工程领域。更具体地讲,鉴定了引导细菌中的嵌合基因表达的新启动子。背景技术:通过微生物来生产乙醇提供了一种替代化石燃料的可供选择的能源,因此成为当前研究的重要领域。希望微生物能够利用木糖作为碳源生产乙醇以及其他有用的产物,因为木糖是水解的木质纤维质材料的主要戊糖,因此能提供丰富可用的低成本碳底物。运动发酵单胞菌(Zymomonasmobilis)和其他乙醇细菌天然不利用木糖,可通过导入基因将它们遗传工程化以利用木糖,导入的基因编码1)木糖异构酶,该酶催化木糖转化成木***糖;2)木***糖激酶,它将木***糖磷酸化以形成5-磷酸木***糖;3)转***醇酶;和4)转醛醇酶。已经成功地工程化了运动发酵单胞菌菌株用于木糖代谢(US5514583、US5712133、US6566107、WO95/28476,Feldmann等人(1992)ApplMicrobiolBiotechnol38=354-361,Zhang等人(1995)Science267240-243),以及工程化了棕榈发酵细菌(Zymobacterpalmae)菌株用于木糖代谢(Yanase等人(2007):2592_2599)。然而工程化菌株通常在木糖上生长和生产乙醇不如在葡萄糖上一样好。就这种工程化而言,编码用于木糖代谢的异源蛋白的基因已经从在运动发酵单胞菌细胞中有活性的启动子上表达,通常是运动发酵单胞菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的启动子或运动发酵单胞菌烯醇酶基因的启动子。工程化以利用木糖的菌株已经适应在木糖培养基上连续传代,所得菌株具有改善的木糖利用率,如美国专利7,223,575以及共有的和共同未决的美国专利申请公布US20080286870所描述。然而仍未确定该改善的遗传基础。需要具有改善的木糖利用率的发酵单胞菌属的遗传工程化菌株和其他乙醇细菌。申请人:已经发现突变体启动子具有提高的活性,这可用于表达木糖利用基因,其活性赋予包含这些启动子的工程化菌株改善的木糖利用率。该启动子也可用于表达其他基因。发明内容本发明涉及分离的突变型启动子,所述启动子用于表达基因,即在发酵单胞菌属、发酵细菌属、以及相关细菌中的嵌合基因,它们引导的基因表达水平比由运动发酵单胞菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(Pgap)的天然启动子引导的基因表达水平更高。该突变型启动子是运动发酵单胞菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因启动子的衍生物,并且由于特定突变的存在而具有提高的活性。该启动子可用于基因工程以表达编码区或表达调控RNA。由这些启动子引导的木糖异构酶的编码区表达导致利用木糖的运动发酵单胞菌在包含木糖的培养基中的生长改善。本文所述的是包含运动发酵单胞菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因启动子的分离的核酸分子,所述启动子在选自-190位、-89位、或-190和-89位两者的位置上具有核苷酸取代;其中所述位置编号是相对于运动发酵单胞菌的CP4和ZM4菌株中的甘油醛-3-磷酸脱氢酶的天然ATG翻译起始密码子。本文还描述了以下内容包含上述分离的核酸分子并可操作地连接至异源核酸分子的嵌合基因;包含上述核酸分子的载体以及对包含导入到细胞中的上述核酸分子的细菌细胞进行基因工程化的方法。附图简沭和序列描述可通过下列发明详述、附图、以及结合作为本专利申请一部分的序列描述,能更全面地理解本发明的多个实施方案。图1示出转***醇酶(A)、转醛醇酶(B)、木糖异构酶(C)、和木***糖激酶(D)的酶检测分析方法。图2是在用PgapxylAB转化的T2C、T3C、T4C、和T5C品系中的木糖异构酶(XI)和木***糖激酶(XK)的活性示意图。图3是在用PgapxylAB转化的T2C、T3C、T4C、和T5C品系中的转醛醇酶(TAL)和转***醇酶(TKT)的活性示意图。图4是选择的适合利用木糖菌落的理论乙醇产率%和木糖利用率%示意图。图5是适合利用木糖的菌株在具有5%葡萄糖(RMG)的RM中生长50代之前和之后,在具有5%木糖(RMX5%)的RM(丰富培养基)上生长70小时时的生长示意图。图6示出以下质粒的图谱(A)pZB188;(B)pZB188/aadA;和(C)pZB188/aadA-GapXylA;以及(D)大肠杆菌木糖异构酶表达盒PgapXylA的示意图。图7示出以下质粒的图谱(A)pM0D-2-;(B)pMOD-Linker;和(C)pMOD-Linker-Spec。图8示出质粒pLDHSp-9ffff的图谱。图9示出质粒pM0D-Linker-Spec-80IGapXylA的图谱。图10示出以下质粒的图谱(A)pM0D-Linker-Spec-80IGapXylA;(B)pZB188/aadA-GapXylA;禾卩(C)pZB188/aadA_801GapXylA。图11示出包含Pgap-大肠杆菌木糖异构酶表达质粒(X1、X2和X2)的三个菌株和包含对照质粒(C1、C2和C3)的三个菌株在包含木糖的培养基中的生长曲线(0D600对时间)。图12示出ZW641、ZW658、X1和Cl菌株在包含木糖的无奇放线菌素培养基中的生长曲线(0D600对时间),(A)对线性尺度作图,而⑶对对数尺度作图。图13示出具有整合801Pgap-XylA(#8-2、#8_4、#8-5)的三个菌株和具有整合641Pgap-XylA(#6-l、#6-3、#6-5)的三个菌株与菌株ZW658相比较的生长曲线(0D600对时间),(A)对线性尺度作图,而(B)对对数尺度作图。图14示出pZB188aadA/Gap/ZymoRPI/EcoliSL的质粒图谱。图15示出(A)pZB188aadA/Gap/ZymoRPI/EcoliSL;(B)pZB188aadA_641GapRPI;和(C)pZB188aadA-801GapRPI的质粒图谱。图16示出来自具有表达RPI的不同启动子的菌株的全细胞蛋白的染色蛋白凝胶。根据下面的详细描述和附带的序列描述可以更充分地理解本发明,下面的详细描述和所附的序列描述形成了本申请的一部分。-("RequirementsforPatentApplicationsContainingNucleotideSequencesand/orAminoAcidSequenceDisclosures-theSequenceRules”(对含有核酸序列和/或氨基酸序列公开的专利申请的要求-序列规则)),anization(世界知识产权组织,WIP0)(1998)以及EPO和PCT的序列清单要求((a-bis)以及AdministrativeInstructions(行政指令)的第208节和附录C)。.§。SEQIDNO=I是来自运动发酵单胞菌的CP4菌株的ZmPgap的核苷酸序列。SEQIDNO:2是来自运动发酵单胞菌的ZM4菌株的ZmPgap的核苷酸序列。SEQIDNO3是来自pZB4的ZmPgap的核苷酸序列,它也位于菌株ZW641和8XL4的PgapxylAB操纵子中。SEQIDNO4是来自菌株ZW658的改善Pgap的核苷酸序列。SEQIDNO:5是来自菌株8b的改善Pgap的核苷酸序列。SEQIDNO6是在Pgap的pZB4突变体中的具有-190(ZW658)和-89(8b)突变的改善Pgap的核苷酸序列。SEQIDNO7是在Pgap的CP4突变体中的具有来自ZW658的-190突变的改善Pgap的核苷酸序列。SEQIDNO8是在Pgap的CP4突变体中的具有来自8b的-89突变的改善Pgap的核苷酸序列。SEQIDNO9是在Pgap的CP4突变体中的具有-190(ZW658)和-89(8b)突变的改善Pgap的核苷酸序列。SEQIDNO10是在Pgap的ZM4突变体中的具有来自ZW658的-190突变的改善Pgap的核苷酸序列。SEQIDNO11是在Pgap的ZM4突变体中的具有来自8b的-89突变的改善Pgap的核苷酸序列。SEQIDNO12是在Pgap的ZM4突变体中的具有-190(ZW658)和-89(8b)突变的改善Pgap的核苷酸序列。SEQIDNO13和14是用于扩增包含来自pZB4的甘油醛_3_磷酸脱氢酶基因启动子(Pgap)的DN***段的引物核苷酸序列。SEQIDNO15和16是用于扩增包含来自pZB4的tal编码区的DN***段的引物核苷酸序列。SEQIDNO17和18是用于扩增包含来自Pgap和tal片段的Pgaptal的DN***5段的引物核苷酸序列。SEQIDNO19和20是用于扩增包含来自pZB186的IoxP::Cm的DN***段的引物核苷酸序列。SEQIDNO:21是pMODPgaptaltktCm质粒的全长核苷酸序列。SEQIDNO22和23是用于扩增在接纳pMODPgaptaltktCm的转化体中包含tal和tkt编码区的3kbDN***段的引物核苷酸序列。SEQIDNO24是pMODPgapxyIABCm质粒的全长核苷酸序列。SEQIDNO25和26是用于扩增来自具有pMODPgapxyIABCm的T2C、T3C、***段的引物核苷酸序列。SEQIDNO27和28是用于扩增包含来自ZW641和ZW658的Pgap编码区的DN***段的引物核苷酸序列。SEQIDNO:29_31是用于对来自ZW641和ZW658的Pgap测序的引物核苷酸序列。SEQIDNO32和33是用于扩增包含Speclr-盒的DN***段的引物核苷酸序列。SEQIDNO34是木糖异构酶表达盒PgapXylA的全长核苷酸序列。SEQIDNO35和36是用于替代pM0D2_中的不同多克隆位点的寡核苷酸的核苷酸序列。SEQIDNO:37和38是用于扩增来自菌株ZW801-4禾口ZW641的PgapxylA区域的引物核苷酸序列,该序列用于插入pMOD-Linker-Spec以分别生成质粒pM0D-Linker-Spec-80IGapXylA和pM0D-Linker-Spec_641GapXylA。SEQIDNO39和40是用于扩增来自pZB188/aadA_641GapXylA的Pgap的引物核苷酸序列,并且包括运动发酵单胞菌RPI开放阅读框的前15bp。SEQIDNO41和42是用于扩增运动发酵单胞菌RPI开放阅读框的引物的核苷酸序列。SEQIDN0:43是RPI表达盒的全核苷酸序列,该表达盒位于质粒pZB188aadA/Gap/ZymoRPI/EcoliSL中。SEQIDNO44和45用于扩增包含来自8XL4和8b的Pgap的DN***段的引物核苷酸序列。SEQIDNO46是用于对来自8XL4和8b的Pgap测序的引物全长核苷酸序列。发明详述本文所述的是可用于表达细菌细胞中的嵌合基因的新启动子。申请人已经发现,运动发酵单胞菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因启动子的两个不同突变每个均分别提高由该启动子引导的表达水平。一个突变在-190位,第二个突变在-89位,两个位置都相对于运动发酵单胞菌的CP4和ZM4菌株中的甘油醛-3-磷酸脱氢酶的天然ATG翻译起始密码子。运动发酵单胞菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因启动子包含这些突变中的任何一个或两者均有,所述启动子可用于在细菌细胞中表达异源的、可操作地连接的DNA序列。以下缩写和定义将用于说明书和权利要求的解释。如本文所用,术语“包含”、“由...组成”、“包括”、“涵盖”、“具有”、“含有”、“包容”或“容纳”或其任何其它变型旨在包括非排他的包含物。例如,包含一系列元素的组合物、混合物、工艺、方法、制品或设备不必仅限于那些元素,而可以包括其它未明确列出的元素,或此类组合物、混合物、工艺、方法、制品或设备固有的元素。此外,除非有相反的明确说明,“或”是指包含性的“或”,而不是指排他性的“或”。例如,以下任何一种情况均满足条件A或B=A是真的(或存在的)且B是假的(或不存在的)、A是假的(或不存在的)且B是真的(或存在的)、以及A和B都是真的(或存在的)。同样,涉及元素或组分例证(即出现)次数的位于本发明元素或组分前的不定冠词“一个”或“一种”旨在是非限制性的。因此,应将“一个”或“一种”理解为包括一个或至少一个,并且元素或组分的词语单数形式也包括复数形式,除非有数字明显表示单数。“基因”指表达特定蛋白质或功能RNA分子的核酸片段,该核酸片段可包含位于编码序列之前的调节序列(5'非编码区)和之后的调节序列(3'非编码区)。“天然基因”或“野生型基因”指具有其自身调控序列的天然存在的基因。“嵌合基因”指不是天然基因的任何基因,包含在天然情况下不是一起存在的调控序列和编码序列。因此,嵌合基因可包括源于不同来源的调控序列和编码序列,或者包括源于同一来源但以不同于天然存在的方式排列的调控序列和编码序列。“内源性基因”指位于生物的基因组内它的天然位置的天然基因。“外来基因”指正常情况下不存在于宿主生物中的基因,它通过基因转移导入宿主生物。外来基因可以包含插入到非天然生物体内的天然基因,或嵌合基因。术语“遗传构建体”指编码表达一种或多种特定蛋白或功能RNA分子的核酸片段。在基因构建体中u基因可以是天然的、嵌合的、或外来的。通常基因构建体将包含“编码序列”。“编码序列”指编码特定氨基酸序列的DNA序列。“启动子”或“启动控制区”指能够控制编码序列或功能RNA的表达的DNA序列。一般来讲,编码序列位于启动子序列的3'端。启动子可整个源于天然基因,或者由源于不同的天然存在的启动子的不同元件组成,或者甚至包含合成的DN***段。本领域内的技术人员应当理解,不同的启动子可以在不同的组织或细胞类型中,或者在不同的发育阶段,或者响应不同的环境条件而引导基因的表达。通常将在大多数细胞类型中、在大多数情况下引