微生物的分子生物学检测方法.pptx

微生物的分子生物学检测方法
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目录
PCR核酸技术
核酸分子技术
结语
PCR核酸技术
聚合酶链反应( PCR)技术自1985年发明以来,各种各样以PCR 为基础的DNA序列的扩增和检测方法得到了迅猛发展。各种衍生技术如反转录PCR ( RTR) 、多重PCR 、巢式PCR、PCR单链构象多态性(PCRSSCP)、限制性片段长度多态性(RFLP)、随机扩增的多态性DNA 技术(RAPD)和重复序列PCR技术(Rep - PCR)、荧光定量PCR等。其中定量PCR 既可以用于临床感染性疾病的诊断,又可用于监测其疗效,PCR及其衍生的技术近年来在病原微生物分型研究上得到了广泛应用。
简介
随机扩增的多态性DNA 技术
重复序列PCR技术
免疫PCR
优点
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随机扩增的多态性DNA 技术
RAPD是目前最简单的DNA分型方法, 分辨力高于RFLP, 但低于Rep-PCR,RAPD技术的使用范围也非常广,分辨结果也有较好的实验室再现性,在疾病暴发流行时,PAPD仍是一种分析相关菌株和排除不相关菌株的良好技术。
缺点
由于其对引物和DNA浓度、DNA模板质量、凝胶电泳和DNA聚合酶类型的变化高度敏感, 故RAPD的重复性不够理想。虽然RAPD的分型结果在不同实验室间变化较大,分辨力不如PFGE技术。
随机扩增的多态性DNA技术(RAPD)是一种典型PCR衍生技术, 在低复性温度下用短任意序列引物(10~15m ers) 扩增有密切同源性的基因组DNA序列, 模板上任意引物杂交点的数目和位置因种的不同株而异, 理论上特定株形成特定图谱。反应出不同菌株基因组的DNA特点,从而对他们进行分型
优点
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重复序列PCR技术
已成功地用于分型的细菌重复DNA序列有肠道菌重复基因间共有(ERIC) 序列、重复基因外回纹序列(REP)和BOX序列的分析,与其他分类技术相比,这种技术有更高的分辨力
缺点
Rep-PCR分辨力稍低
重复序列PCR技术(Rep-PCR)是利用细菌基因组中广泛分布的短重复序列为引物靶序列,进行PCR扩增,通过对PCR产物电泳结果的比较,分析菌株间基因组存在的差异
具有一定互补序列的核苷酸单链在液相或固相中按碱基互补配对原则缔合成异质双链的过程叫核酸分子杂交。具有一定同源性的原条核酸单链在一定的条件下(适宜的温室度及离子强度等)可按碱基互补原成双链。杂交的双方是待测核酸序列及探针(probe),待测核酸序列可以是克隆的基因征段,也可以是未克隆化的基因组DNA和细胞总RNA。
核酸分子杂交技术
特点
应用
(1)灵敏度高、特异性强;
(2)用于 DNADNA和RNARNA的定性、定量检测。
(1)检测特异 DNADNA序列
(2)特异基因克隆的筛选;
(3)核酸序列的初略分析;
(4)PCR技术的分子基础。
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Northern 印迹杂交 :基本原理与Southern印迹杂交相同,不同的是它检测mRNA而不是DNA,因此可分析和了解基因的表达状态。
Southern印迹杂交:根据基因探针与待测DNA限制酶酶解片段杂交的带谱,可以直接确定宿主基因的缺陷所在或病原体的存在状态
原位杂交