遗传性fv缺陷症和遗传性at缺陷症的分子病理机制分析.docx

L海第二医科大学博士学位论文
遗传性FV缺陷症和遗传性AT缺陷症的分子病理机制研究
中文摘要
凝血因予与抗凝因子是维持机体正常止血机能和防止血栓形成的重要成分。临床上,凝血因子或抗凝因子缺陷主要原因可分为两大类:遗传性和继发性。遗传性凝血因子和抗凝因子缺陷症为单基因遗传性疾病,虽然发生率并不高,但危害性极大,不仅给患者造成终身的痛苦,而且还可遗传给后代。对先证者相关基因突变的发现不但有助于优生优育,而且也为深入认识相关凝血因子和抗凝因子蛋白质结构与功能的关系提供线索。同时,研究不同的基因突变所引起的临床表型的差异及其与现有的凝血理论问的矛盾也将有助于完善人们对机体凝血与止血机制的认识。
遗传性凝血因子V(Fv)缺陷症,是一种常染色体隐性遗传性出血性疾病,发生率约为1/1 000 000。本文所研究的3个家系,先证者l、2和3分别为16岁女性、36岁男性和18个月的男孩。先证者2的父母为近亲婚配。先证者1无自发性出血现象,而其他2个先证者均表现为严重的出血倾向。表型检测发现,3例先证者均表现为活化部分凝血活酶时间(APTT)和血浆凝血酶原时间(PT)的显
著延长,FV抗原(FV:Ag)和FV活性(FV:C)均显著降低,FV:Ag %、%%,FV:%、%%。对 F5基因所有外显子及其侧翼序列的测序分析表明,先证者I和先证者3均为F5基因双杂合突变,分别为GI 628A和4887~8delG以及
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2238~9delAG和G6326T,>G纯合突变。G1628A和G6326T点突变分别导致编码的FV蛋白Gly392Cys和Gly2079Val替换;对108例健康***的分析均未发现这2种点突变,排除了基因多态性的可能。 2238~9delAG和4887~8delG突变,将分别导致编码的FV蛋白在689 位和1590位出现终止密码,形成截短型的Fv蛋白。
遗传性抗凝血酶(antithrombin,AT)缺陷症多为显性遗传,在人群中的发生率为2/10 000~5/10 000,是静脉血栓栓塞(venous thromboembolism,VTE)的主要遗传性危险因素之一,在VTE患者中的发牛率为1%~8%。本文研究的先证者为男性,18岁,临床诊断为肺栓塞和双下肢深静脉血栓形成。表型检测发现,AT抗原(AT:Ag) ,AT活性(AT:A)%,而PC抗原和活性以及总
PS和游离PS均在正常范罔之内。对先证者AT基因7个外显子及其侧翼序列测序分析表明,先证者AT基冈存在13387—9delG杂合突变, 该突变将导致其编码的AT蛋白在426位出现终止密码,使产生的突变AT缺少C端6个氨基酸(amino acid,aa)残基。对13387—9delG 突变体表达质粒(ATM)转染c0S7细胞的研究表明,在细胞培养上清液中检测不到AT抗原,而在细胞裂解液中,其AT抗原仅为转染正常AT表达质粒(ATN)的27,13%。Pulse—Chase试验发现,在培养上清液中,检测不到35S标记的AT蛋白,在chase 0rain时,ATM 细胞内”%;在chase 180rain时,
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ATM细胞内35S标记的AT蛋白为0min时的50%2兰右。细胞免疫荧
光试验的结果表明,ATM细胞内荧光强度明显低于ATN。本文同时对2种纯合子型AT缺陷症的AT基因突变进行了体外
表达研究。C2603T突变导致编码的AT蛋白Ar947Cys替换,转染 C2603T突变体表达质粒(AT2603)的COS7细胞,培养上清液和细胞裂解液中的AT:%并n %,而培养上清液中的AT:A为O。说明Ar947Cys突变主要影响AT功能。C2759T突变导致编码的AT蛋白Leu99Phe替换,转染C2759T突变体表达质
粒(AT2759)的COS7细胞,培养上清液和细胞裂解液中的AT:%和1 %,而培养上清液中的AT:
%。细胞免疫荧光试验也证实,转染AT2759的CHO细胞,其荧光强度明显高于转染ATN的CHO细胞。说明Leu99Phe突变的AT, 存在明显的细胞内滞留现象,而其肝素结合能力并不降低。
本研究对3个Fv缺陷症家系和1个遗传性AT缺陷症家系分别进行了F5基因和AT基因缺陷的研究,同时对发现的1种新AT基因突变以及引起II型纯合AT缺陷症的2种AT基因突变进行了体外表达研究,以探讨其分子病理机制。从以上研究结果中,可以得出以下结论