原生质体融合技术.ppt

导致微生物遗传物质发生重组的生物学途径有:
(1)杂交(在低等生物中是接合),这是完整的活细胞之间的接触,导致遗传物质转移的过程;
(2)转化,从供体微生物细胞内抽提出来的游离DNA直接穿过受体细菌细胞壁进入细胞中的过程(此时受体细菌处于能接受外源DNA的细胞生理状态称为感受态);
(3) 转导,通过温和噬菌体把细菌 DN***段从一个细菌转入另一个细菌细胞中的过程。
由于细胞壁的存在,使细胞与细胞之间缺乏沟通的渠道,不能进行遗传物质的传递。但是近年来由于在微生物中引入了细胞融合新技术即原生质体融合新技术,从而打破了不能充分利用遗传重组的局面。
原生质体融合技术
一、微生物细胞融合技术
图1-l 微生物原生质体融合简单示意图
a、b、c、d、e、f-亲本细胞遗传标记〔营养缺陷型〕;
图1-4 革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌细胞壁的比较
G+革兰氏阳性
G-革兰氏阴性
1、细菌细胞壁的结构
2、细菌细胞壁的溶解
细菌细胞壁使细菌保持一定的形状,并保持细胞的完整性。细胞壁还具有保护作用,一则可防御外界生理活性物质损伤菌体,以维持细菌细胞的生命。一则抵御水的渗入、大多数细菌的环境具有的溶质浓度比细菌细胞内的溶质浓度低得多,细胞内的溶质浓度接近10mmol/L、水通过渗透作用从低溶质浓度区域流向高溶质浓度区域。如果没有坚固的细胞壁,水便会渗进细胞内使细胞膨胀、破裂。但也正是这一层坚厚的细胞壁,阻止了不同细胞间内含物的接触混合,从而阻止了遗传信息的重组。
要使不向细胞遗传信息发生重组,需要除去细胞壁,一个普遍采用的重要方法就是使用细胞壁溶解酶。细胞壁溶解酶(简称溶菌酶)广泛存在于高等动物组织及分泌物、原生动物、昆虫、植物和各种微生物中,以新鲜鸡卵白中含量最高,%左右。细胞壁溶解酶在学术上的作用很大,。
各种细菌细胞壁中的肽聚糖对细胞壁溶解酶的敏感性因细胞壁的组成与构造而异,一些革兰氏阴性菌对卵清溶菌酶有抗性,原因之一是细胞壁中含大量6-O-二乙酰胞壁酸。如把肽聚糖从革兰氏阴性菌中分离出来,离析出的肽聚糖同样易被溶菌酶所分解、将金黄色葡萄球菌细胞壁中的磷壁酸抽出,,处于对数生长期的菌体,细胞壁中肽聚糖含量最低,对溶菌酶最敏感。活细胞与离体细胞壁对溶菌酶的抗性也不相同。
将细胞用酸、碱、加热、冷冻或用表面活性剂、EDTA、三***乙酸、***等处理,可使许多对溶菌酶有抗性的细菌变成容易溶解,尤其是对革兰氏阴性菌更为明显。例如;添加碱,可大大促进溶菌酶的作用,使不少抗性菌株,象沙门氏菌、志贺氏菌和绿脓杆菌、大肠杆菌等充分溶解。植酸钙、氨基酸、有机酸等可增强卵清溶菌酶的作用,而CMC、果胶、琼脂等可削弱溶菌酶的作用。氨基酸的衍生物如N-硬脂酸基谷氨酸、N-棕榈酸基天冬酰***可增强卵清溶菌酶或枯草杆菌溶菌酶对革兰氏阴性菌的作用。
3、渗透稳定剂
细菌细胞壁一旦被溶菌酶破坏除去,便裸露出只由原生质膜包围的一团细胞浆。原生质膜很脆弱,也不能阻止环境中的水分渗进细胞,结果是,在普通低渗溶液或低渗培养基里,细胞便不断吸水膨胀,终至破裂。如果在溶液中加入不能渗入细胞的某种溶质(例如蔗糖),使溶液中溶质的浓度与细胞内的溶质浓度平衡,剥去细胞壁的原生质体便不致破裂。在这种高渗溶液里原生质体呈球状。
细菌中常用的渗透稳定剂有SMM液,,, MgCl2·6H2O 。用于芽孢杆菌原生质体的制备及融合,棒状杆菌原生质体的制备及融合采用DF液,,,EDTA ,K2HPO4 ,KH2PO4 ,MgCl2·6H2O 。
使原生质体回复到原来的细胞形状需要再生出细胞壁,将原生质体置于高渗再生固体培养基中,经培养后有一定比例的原生质体可再生细胞壁、根据文献报道,细菌的再生率一般为3~10%。
枯草杆菌用的高渗固体培养基为DPA培养基,, 。,。有一报道说在SMM中加入牛血清白蛋白制成的再生培养基,可使枯草杆菌原生质体100%回复
4、原生质体融合的促融合剂
早期的原生质体融合实验曾采用离心力的方法,使两种不同细胞的原生质体紧紧挤在一起而实现融合,或者在冷的渗透稳定剂中使原生质体密集凝聚。直至1974年,Kao和Michayluk发现聚乙二醇(PEG)可以作为植物原生质体的促融合剂,这一化合物即被用于微生物原生质体、动物原生质体