基因敲除技术.docx

基因敲除技术研究进展综述
摘要: 基因敲除在20世纪80年代发展起来后已经应用到许多领域, 如建立人类疾病的转基因动物模型(糖尿病转基因小鼠、神经缺损疾病模型等)。这些疾病模型的建立使研究者可以在动物体内进行疾病的研究: 研究发育过程中各个基因的功能, 研究治疗人类遗传性疾病的途径。
关键字: 基因敲除;Cre/LoxP系统;基因载体;生物模型
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基因敲除又称为基因打靶, 是指从分子水平上将一个基因去除或替代, 然后从整体观察实验动物,推测相应基因功能的实验方法,是功能基因组学研究的重要研究工具。是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术。
通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理,用设计的同源片段替代靶基因片段,从而达到基因敲除的目的。随着基因敲除技术的发展,除了同源重组外,新的原理和技术也逐渐被应用,比较成功的有基因的插入突变和iRNA,它们同样可以达到基因敲除的目的。
基因敲除已成为当前医学和生物学研究的最热点与最前沿, 并已对生物学和医学的许多研究领域产生深刻的影响, 成为革命性的研究工具, 具有极其重要的理论意义和实践意义。
基于基因敲除技术对医学生物学研究做出的重大贡献,在该领域取得重大进展的三位科学家,70岁的美国人马里奥•卡佩奇(Mario hi)、82岁的美国人奥利弗•史密西斯(Oliver Smithies)和66岁的英国人马丁•埃文斯(Martin Evans)分享了2007年诺贝尔生理学或医学奖。

80年代末期的基因敲除技术为第一代技术,属完全性基因敲除,不具备时间和区域特异性。关于第二代区域和组织特异性基因敲除技术的研究始于1993年。Tsien等于1996年在《Cell》首先报道了第一个脑区特异性的基因敲除动物,被誉为条件性基因敲除研究的里程碑。该技术以Cre/LoxP系统为基础,Cre在哪种组织细胞中表达,基因敲除就发生在哪种组织细胞中。
2000年Shimizu等[于《Science》报道了以时间可调性和区域特异性为标志的
第三代基因敲除技术,其同样以Cre/LoxP系统为基础,利用四环素等诱导Cre的表达。该技术使目的基因的敲除在时间上可人为控制,避免了死胎或动物出生后不久即死亡等现象的出现。
2004年该实验室Cui[等又报道了第四代基因工程技术,即可诱导的区域性蛋白质敲除技术,用这一技术构建的模式动物可在几分钟内反转性地激活或敲除特定蛋白质的功能,从根本上改变了前三代基因敲除技术对蛋白质代谢速度的内在依赖性,达到空前的时间精度,成为目前功能基因组和功能蛋白质组研究最先进的工具之一。
然而,长期以来上述基因敲除技术只能在小鼠上完成,因为只有小鼠的ES细胞能在体外培养中无限增殖并同时保持多分化潜能。但我们知道,大鼠、家兔、猪以及猴等大动物模型在疾病研究中更接近于人类,大动物更有益于某些繁琐的手术操作,同时血浆及组织样本量较多,更有益于研究。
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利用基因打靶技术产生转基因动物的程序一般为:
细胞的获得:现在基因敲除一般应用于鼠,而最常用的鼠的种系是129及其杂合体,因为这类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向,是基因敲除的理想实验动物。而其他遗传背景的胚胎干细胞系逐渐被发展应用,最近来自于C5