新克隆技术-不用酶切位点,直接克隆.pptx

In-Fusion克隆技术介绍
July 21, 2018
宝日医生物技术(北京)有限公司
主要内容
7/21/2018
In-Fusion克隆技术介绍
2
1
In-Fusion®技术原理
3
In-Fusion®应用实例
4
In-Fusion®应用文献
2
In-Fusion®实验方法
In-Fusion®技术原理示意图
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In-Fusion克隆技术介绍
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In-Fusion酶
Clontech专利
50 ℃,15 min单管反应
In-Fusion®技术特点
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In-Fusion克隆技术介绍
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开放性
无缝
克隆
多片段
克隆
In-Fusion
不受载体限制
不受酶切位点限制
不附加任何冗余序列
一次反应
单管操作
阳性率高达80%
主要内容
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In-Fusion克隆技术介绍
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1
In-Fusion®技术原理
3
In-Fusion®应用实例
4
In-Fusion®应用文献
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In-Fusion®实验方法
实验方法
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In-Fusion克隆技术介绍
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引物设计
PCR扩增
片段和载体酶切处理
连接体系建立
引物设计
PCR扩增
载体线性化
连接体系建立
传统基因克隆操作流程
In-Fusion基因克隆操作流程
引物设计
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普通PCR引物
In-Fusion PCR引物
保护碱基序列
完整的酶切位点
与目的基因片段相同/相互补
的特异碱基序列
15 bp同源
碱基序列
补齐酶切位点
缺失碱基
与目的基因片段相同/相互补
的特异碱基序列
5′-
-3′
-3′
5′-
In-Fusion®引物设计原则
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平末端和黏性末端均可直接进行in-fusion连接
选择与载体末端相同的15 bp同源碱基序列
补齐酶切位点缺失碱基
同源序列部分是与线性化载体末端5’end前15 bp相互补的碱基序列
无需进行末端补平或者去磷酸化处理
若保留酶切位点,需补齐酶切位点缺失碱基
In-Fusion®引物设计原则
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平末端和黏性末端均可直接进行in-fusion连接
无需进行末端补平或者去磷酸化处理
In-Fusion®引物设计---原则1
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In-Fusion克隆技术介绍
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黏性末端
(5’悬挂)
黏性末端
(3’悬挂)
平末端