11 转氨酶.ppt

实验九转氨酶活力的测定(分光光度法)
一、实验目的。。
二、实验原理生物体内广泛存在的氨基转移酶也称转氨酶(transaminase),能催化α-氨基酸的α-氨基与α-***酸的α-***基互换,生成相应的***酸和氨基酸。转氨酶的种类很多,广泛存在于有机体的各种组织中,在肝、心、肾等组织中的谷丙转氨酶(glutamic pyruvic transaminase, GPT)和谷草转氨酶(glutamic oxalacetic transaminase, GOT)的活性较高。
在正常新陈代谢过程中,血清中只含有少量转氨酶。
当肝、心、肾等器官病变导致肝炎、心肌梗死等病患时,由于组织细胞坏死使得大量转氨酶释放到血液中,从而引起血清中转氨酶活力显著升高,因此,测定血清转氨酶活力对某些疾病的临床诊断具有重要的参考价值。
本实验用丙氨酸和α-***戊二酸为底物,经谷丙转氨酶作用生成谷氨酸及***酸,***酸与2,4-二硝基苯肼反应生成***酸2,4-二硝基苯腙,后者在碱性溶液中呈现棕色(30min~2h内色度稳定),其吸收光谱为439~530nm,可用于测定***酸2,4-二硝基苯腙的生成量或***酸的消耗量,由此计算转氨酶的活力(1μmol***)。其反应过程如下:
肼
三、器材
试管(16支)及试管架;移液器(,1mL,5mL);恒温水浴锅;可见分光光度计
四、试剂
磷酸盐缓冲液(pH ) ; ***酸钠标准溶液: 称取分析纯***酸钠22mg溶解于50mL磷酸缓冲液内(现用现配);
:称取分析纯α-***(2mmol/L)及L-(100mmol/L)溶于50mL pH ,,加入磷酸缓冲液定容至100mL,加入数滴***仿防腐,溶液在冰箱内可保存一周;
,4-二硝基苯肼(1mmol/L): 称取2,4-二硝基苯肼20mg,先溶于50mL 2mol/L盐酸中,然后再加入蒸馏水定容至100mL;
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五、操作步骤
(一).样品制备
:从兔的四肢静脉抽血,放入离心管中,室温下凝固,析出血清,6000r/min离心20min,取淡黄色上清液,为兔血清。冰箱保存。
:称取新鲜或冷冻的兔肝,按1︰1(质量体积比) 磷酸盐缓冲液(pH ),冰浴下研磨或匀浆30min,将匀浆转移到离心管,4℃6000离心6000r/min离心20min, 弃沉淀,上清液即为转氨酶粗酶液,使用前稀释5倍。
所有实验组共用10g兔肝,制备兔肝转氨酶粗酶液,测量体积,记为V肝(mL): mL 。
(二).绘制标准曲线
取6支试管,按表1所列的次序添加各种试剂并作平行实验: