[硕士论文]帕金森病致病基因Parkin的功能研究.pdf

上海第二医科大学
博士学位论文
帕金森病致病基因Parkin的功能研究
姓名:杨卉
申请学位级别:博士
专业:神经病学
指导教师:陈生弟
20040501
帕金森病致病基因的功能研究中文摘要帕金森病’琍是一种中老年人常见的神经系统变性疾病,以黑质多巴胺能神经元选择性变性缺失和路易小体纬晌2理学特征。至今,的病因和发病机制不明。近年来,遗传性帕金森病致病基因的相继发现为阐明的发病枫制带来了新的希望。基因是最近被克隆的常染色体隐性遗传性青少年型帕金森综合征甁的致病基因;早发性散发性帕金森病患者中也存在着基因的多种突变。而且,绝大多数—患者脑内没有小体形成。这些证据表明基因很可能在遗传性帕金森病和原发性帕金森病的共同致病机制巾发挥关键作用,可能影响小体形成。本研究采用基因工程手段,克隆了人野生型基因的全氏,构建了人野生型基因的真核表达质粒,筛选获得稳定过表达人基因的细胞克隆;观察基因过表达能否影响蛋白酶体抑制剂导的细胞凋亡和胞浆内包涵体生成;建立了基因小干扰闹柿1泶系统,通过瞬时转染细胞鉴定它们抑制基因表达的效果,为基因的功能研究提供一种新的赴P停簧秆』竦梦榷ㄒ种芇基因表达的细胞克隆,初步探讨了基因功能缺陷对于细胞的活力、氧化应激反应以及蛋白酶体抑制剂毒性易感性的影响,为进一步的研究奠定基础。本课题分成四部分:∽躌,用方法获得人野生型基因的全长,≡,采用和方法鉴定人野生型基因在细胞中的过表达。结果显示:酶切图谱分析和蛄胁舛ㄖな的5诙嚼笱Р┦垦宦畚‘
的基因已插入重组质粒,和证明经筛选得到的转基因细胞克隆中存在人基因的高表达。甈蚬泶镆种频鞍酌柑逡种萍羖对细胞毒性作用的实验研究采用ḿ觳獠煌亮康鞍酌柑逡种萍羖对过表达基因的细胞的毒性作用;用ü馊旧约傲魇较赴觳庀赴蛲觯挥肳检测活性片段以及泛素化蛋白质;用免疫荧光法检测胞浆内泛素/免疫阳性包涵体的生成。结果显示:基因过表达能抑制盏嫉腜赴蛲觯跎賑幕化;能够促进盏嫉陌诜核兀疺庖哐粜园宓纳伞种芇虻男「扇臨表达载体系统的建立及其扇判Ч评价设计并合成三对基因的押塑账崞危牒腥薝蚱动子序列的质粒载体樱庑蛘泛蠼溲强寺≈帘泶镌靥錺—,利用脂质体将重组质粒瞬时转染细胞,采用方法鉴定细胞中蛋白的表达水平。结果显示:三种重组质粒狢疪、狢疪和瓹疪寄苊飨砸种芇鞍椎谋泶铮种效率约为%~%。甈虮泶锵碌魉鹕薖赴寡趸せ埔约霸銮康鞍酌柑逡制剂毒性作用的实验研究利用脂质体将重组质粒瓹疪转染细胞,经筛选获得抗性细胞克隆,采用方法鉴定细胞中蛋白的表达水平。用分光光度仪检测未转染质粒、转染空质粒狢约白H局刈橹柿瓹疪的各组细胞中的俊含量、富盍总富盍Γ徊捎谩疢法检测不同剂量蛋白酶体抑制剂訮基因表达下调的细胞的毒性作用。结果显示:稳定转染重组质粒瓹腜赴蠵鞍椎谋泶锼矫飨韵陆担籔基因的表达下调能使细胞内亢蚐酶活力显著降低,但没有改变细胞内亢妥躈酶活力;而且,基因表达下调能使细胞对于蛋上海第二医科大学博士学位论文
细胞的抗氧化和自由基清除机制;能使多巴胺能细胞对于蛋白酶体抑制剂的每牲白酶体抑制剂亩拘宰饔酶C舾小综上,本研究表明:晒菇巳艘吧蚉虻恼婧吮泶镌靥錺/,并且筛选获得了稳定高表达人基因的细胞克隆。甈蚬泶锬芄幌灾种频鞍酌柑逡种萍羖诱导的细胞凋亡,减少幕罨荒芄淮俳鴏引起的无细胞毒性的泛素/免疫阳性包涵体的生成。提示基因可能具有细胞保护作用,可能在帕金森病患者小体生成过程中发挥重要作用。⒘巳终攵源笫驪虻男「扇臨质粒表达系统;通过在细胞中的瞬时表达,证实它们能显著抑制内源性基因的蛋白质表达;为基因的功能研究提供一种新颖实用的赴P汀肞虻男「扇臨质粒表达系统,建立了稳定抑制基因表达的细胞模型;体外实验显示基因表达下调能损伤多巴胺能作用更为敏感。【关键词】帕金森病发病机制扇胖柿【:海第二医科大学博士学位论文
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第一部分人野生型基因真核表达载体的构建及其在细胞中的表达示早发性散发性帕金森病患者中也存在亩嘀滞槐洹;这提示引言基因是年由等发现并命名的常染色体隐性遗传性青少年型帕金森综合征甁的致病基因,定位于.”。,的功能研究取得了初步进展,但其确切的生物学作用仍不清