[优秀论文]肝再生增强因子的重组表达及其抗肝纤维化作用研究.pdf

上海第二医科大学
博士学位论文
肝再生增强因子的重组表达及其抗肝纤维化作用研究
姓名:熊伍军
申请学位级别:博士
专业:内科学、消化病学
指导教师:邱德凯

肝再生增强因子的重组表达及其抗肝纤维化作用研究中文摘要博士研究生邱德凯教授/方法:熊伍军导/背景/模郝愿窝资茄现匚:ξ夜嗣墙】档囊恢殖<膊。蟛糠致肝炎患者可发展为肝纤维化、肝硬化,目前尚无确切有效的治疗方法。近年研究表使通过基因过程方法制各大量重组晌?赡堋!勘究翁馐紫裙鄄炝藀。师明肝纤维化的发生、发展与肝细胞再生过程密切相关,调控肝细胞的再生是肝纤维化防治的一条新的重要途径。肝再生增强因子切陆⑾值囊恢执俳蜗切除后再生肝脏的肝刺激因子俑蜗赴ひ蜃掖汲恋怼超滤、层析、聚丙烯酰***凝胶电泳等过程纯化而得到,其制备过程复杂、得率低、成本高,限制了对镅Щ钚约捌溆τ醚芯俊/克隆的完成在慢性肝炎、肝纤维化中的作用,为利用垢蜗宋峁┎糠掷砺垡谰荩蝗缓量的,初步观察在肝纤维化防治中的作用,探讨其可能作用机制,以期为肝纤维化的防治提供~条新的可能途径及新的可能作用因子。对蜗宋锬P痛笫蟾喂δ堋⒀G甯蜗宋副昙案卧嘧橹宋潭确者肝功能、血清肝纤维化指标的影响。次南妆ǖ赖拇笫驛核苷酸序列设计合成引物,利用抽提试剂盒从乳鼠肝组织中提取,经扩增出克隆质粒、原核表达质粒用傅淖用下构建/吮泶镏柿#5即蟪Ω司ㄑ粜钥寺。粜员泶镏胞再生的重要生长因子,天然饕J峭üɡ丛从诙先椴溉槎锔卧嗷虿糠指通过构建大鼠吮泶镏柿#盏糀在大肠杆菌中表达,制备并纯化了大通过建立四***化碳蜗宋锬P停谔迥诠鄄炝藀级的影响:并于临床收集慢性乙型肝炎患者例,观察了对慢性乙型肝炎患腸危⒖寺∪雙甌质粒,酶切鉴定阳性克隆,阳性克隆扩增并进行核苷酸序列测定。玴疉分别经酶切,回收酶切片段,回收酶切片段在肝再生增强因子的重组表遮磊其抗肝辑焦堡堡曼曼零【~/一。
促群錾懦措***耐慢性肝关键词肝再生增疽看;重组羞看肝芽蕹毳低血清细胞外基质水平,降低肝组织纤维化程度,具有显著的抗肝纤维化作用。∥/炎肝星状细胞粒进行核苷酸序列分析,阳性表达菌用诱导泶铮璖聚丙烯酰***凝胶电泳纯化并鉴定。ü涸福吹鞍酌腹嘧菝芏壤胄姆掷赴旰统上宋赴闣增殖的影响,用放免法及ú舛ㄆ渑嘌结果:畃上灾纳剖笛樾愿蜗宋奥砸倚透窝谆颊吒喂δ堋⒔档血清肝纤维化指标水平及肝组织纤维化程度分级,可用于慢性肝炎肝纤维化的防治,为利用垢蜗宋峁┝#塑账嵝蛄蟹治霰砻鞑迦氲腁核苷酸序列完全一致。晒Φ毓菇薃原核表达质粒完整地插入了多克隆位点,其阅读框正确,经诱导、纯化得到大量。晒⒘薍细胞株,为体外筛选抗肝纤维化作用药物提供了方便的细胞模型。体外观察发现可抑制细胞株的增殖及其细胞外基质的合成,而对大鼠成纤维细胞株脑鲋臣跋赴外基质的合成无明显影响。畆上灾纳艭肝纤维化模型大鼠肝功能,降结论:可用于慢性肝炎肝纤维化的防治,为利用垢蜗宋峁┝部分理论依据。通过基因工程刈榧际醭晒菇舜笫驛高效原核表达质粒/⒃诖蟪Ω司鶻中获得成功表达,所得重组蛋白经复性后,于体外实验证明可抑制肝星状细胞株的增殖及细胞外基质的合成,于体内实低肝组织纤维化程度,具有显著的抗肝纤维化作用。本课题的完成为肝纤维化的防细胞株大鼠肝星状细胞米贤庀哒丈溆盏糎发生突变,利用有限稀释法获得克隆,并逐步扩增建立赴辍S谔逋庥盟嵝粤姿崦阜ü鄄炝藃源笫清中细胞外基质水平,观察对其细胞外基质合成的影响。ü肝纤维化动物模型,观察对肝纤维化动物模型肝功能、血清细胞外基质水平及肝组织纤维化程度的影响。完整地插入了核苷酸序列与文献报道的大/塑账嵝蛄蟹治霰砻鰽验证明可改善肝纤维化模型大鼠肝功能、降低血清细胞外基质水平、降治提一条新的可能途径及作用因子。鼠肝再生增强因子的楣锛捌淇垢蜗宋饔醚芯、/~~/,
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第一部分促肝细胞生长因子抗肝纤维化作用的实验及临床研究第一节促肝细胞生长因子对实验性肝纤维化的疗效观察前言年戎な挡糠指吻谐拇笫笤偕卧冉纳锨逡褐写嬖诖碳じ卧生的物质,称为肝再生刺激因子琀緇】。以后许多学者分别从人胚胎、乳猪及新生小牛的肝脏组织中都分离到这种广泛存在于多种哺乳动物肝组织中的刺激生长因子,并对拇炕吧镅Щ钚越辛斯惴旱难芯俊巧】。我国学者将这种从胎肝或再生肝中提取和分离的复合因子称为促肝细胞生长,杂敫蜗赴ひ蜃酉嗉穑浔局噬嫌際相同许多细胞因子参与肝再生的调控,如肝细胞生长因子⒆;ひ蜃右【—、表皮生长因子⒁鹊核匮ひ蜃等,但它们都缺乏特异