细胞转染技术原理及应用.doc

常规转染技术可分为两大类,一类是瞬时转染,一类是稳定转染(永久转染)。前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中,因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数,产生高水平的表达,但通常只持续几天,多用于启动子和其它调控元件的分析。一般来说,超螺旋质粒DNA转染效率较高,在转染后24-72小时内(依赖于各种不同的构建)分析结果,常常用到一些报告系统如荧光蛋白,β半乳糖苷酶等来帮助检测。后者也称稳定转染,外源DNA既可以整合到宿主染色体中,也可能作为一种游离体(episome)存在。尽管线性DNA比超螺旋DNA转入量低但整合率高。外源DNA整合到染色体中概率很小,大约1/104转染细胞能整合,通常需要通过一些选择性标记,如来氨丙基转移酶(APH;新霉素抗性基因),潮霉素B磷酸转移酶(HPH),胸苷激酶(TK)等反复筛选,得到稳定转染的同源细胞系。
转染技术的选择对转染结果影响也很大,许多转染方法需要优化DNA与转染试剂比例,细胞数量,培养及检测时间等。一些传统的转染技术,如DEAE右旋糖苷法,磷酸钙法,电穿孔法,脂质体法各有利弊,其主要原理及应用特点见下表:
转染方法
原理
应用
特点
磷酸钙法
磷酸钙DNA复合物吸附细胞膜被细胞内吞
稳定转染
瞬时性转染
不适用于原代细胞
操作简便但重复性差
有些细胞不适用
DEAE-右旋糖苷法
带正电的DEAE-右旋糖苷与核酸带负电的磷酸骨架相互作用形成的复合物被细胞内吞
瞬时性转染
相对简便、结果可重复
但对细胞有一定的毒副作用
转染时需除血清
电穿孔法
高脉冲电压破坏细胞膜电位,DNA通过膜上形成的小孔导入
稳定转染
瞬时性转染
所有细胞
适用性广但细胞致死率高,DNA和细胞用量大, 需根据不同细胞类型优化电穿孔实验条件
病毒介导法
通过侵染宿主细胞将外源基因整合到染色体中
稳定转染
可用于难转染的细胞、原代细胞,体内细胞等
逆转录病毒
特定宿主细胞
但携带基因不能太大细胞需处分裂期
需考虑安全因素
腺病毒
通过侵染宿主细胞将外源基因整合到染色体中
瞬时转染
特定宿主细胞
可用于难转染的细胞
需考虑安全因素
阳离子脂质体法
带正电的脂质体与核酸带负电的磷酸基团形成复合物被细胞内吞
稳定转染
瞬时性转染
所有细胞
适用性广,转染效率高,重复性好,但转染时需除血清。转染效果随细胞类型变化大
Biolistic颗粒传递法
将DNA用显微重金属颗粒沉淀,再将包被好的颗粒用弹道装置投射入细胞,DNA在胞内逐步释放,表达
瞬时性转染
可用于:人的表皮细胞,纤维原细胞,淋巴细胞系以及原代细胞
显微注射法
用显微操作将DNA直接注入靶细胞核
稳定转染
瞬时性转染
转染细胞数有限,多用于工程改造或转基因动物的胚胎细胞
(各种转染方法的比较)
     除上述传统方法外,近年来国际上推出了一些阳离子聚合物基因转染技术,以其适用宿主范围广,操作简便,对细胞毒性小,转染效率高受到研究者们的青睐。其中树枝状聚合物(Dendrimers)和聚乙烯亚***(Polyethylenimine,PEI)的转染性能最佳,但树枝状聚合物的结构不易于进一步改性,且其合成工艺复杂。聚乙烯亚***是一种具有较高的阳离子电荷密度的有机大分子,每相隔二个碳个原子,即每“