DNA的定量测定.ppt

DNA 的定量测定
(二苯***法)
指导老师:龚熹
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实验目的:
学****和掌握二苯***法测定DNA含量的原理和方法。
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实验原理:
DNA在20—200微克范围内,光密度与DNA的浓度成正比,可用比色法测定。在反应液中加入少量乙醛,可以提高反应灵敏度。除DNA外,脱氧木糖,阿拉伯糖也有同样反应。其它多数糖类,包括核糖在内,一般无此反应。。
DNA分子中的脱氧核糖基,在酸性溶液中变成ω-羟基-γ-***基戊醛,与二苯***试剂作用生成蓝色化合物,在595nm处有最大吸收。(λmax=595nm)。
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实验器材:
恒温水浴锅
722型分光光度计
移液管
试管
25ml容量瓶
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实验试剂:
DNA标准溶液(200微克/毫升)
二苯***试剂:用前加入乙醛溶液
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操作:

将上周实验提取的DNA粗品12000rpm离心10mins,弃去上清(酒精),室温放置,待乙醇挥发尽后加入蒸馏水溶解,定容至25ml,待测。
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取6支试管,编号,按下表加入试剂
加毕,摇匀,于60℃恒温水浴中保温45min,以光密度为纵坐标,DNA含量(μg)为横坐标,绘制标准曲线。
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取2支试管,各加1ml的待测液,加蒸馏水1ml,再加4ml二苯***试剂,摇匀,于60℃恒温水浴中保温45min ,冷却,测定A595值。
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根据所测得的吸光度对照标准曲线求得DNA的质量(μg )。
按下式计算样品中DNA的含量
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注意事项:
1、二茉***法测定DNA含量灵敏度不高,待测样品中DNA含量低于50mg/L即难以测定。乙醛可增加二苯***法测定DNA的发色量,又可减少脱氧木糖和阿拉伯糖的干扰,能显著提高测定的灵敏度。
2、样品中含有少量RNA并不影响测定,但因蛋白质、多种糖类及其衍生物、芳香醛、羟基醛等能与二苯***反应形成有色化合物,故能干扰DNA定量。
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