斜卧青霉基因表达谱的差异分析研究.pdf

山东大学
博士学位论文
斜卧青霉基因表达谱的差异分析研究
姓名:郑凯
申请学位级别:博士
专业:微生物学
指导教师:曲音波
20091012
摘要条件下的基因表达差异纤维素是自然界中丰富的可再生资源,在石油资源日益紧张的国际环境中,利用纤维素降解生产的生物燃料,作为一种可再生生物质能源已受到普遍关注。利用微生物产生的纤维素酶降解纤维类物质,反应条件温和,易于控制,对环境无污染,有利于促进人类社会的可持续发展,已广泛地应用于能源、纺织、造纸、印染、食品等多个行业。在产生纤维素酶的微生物中,丝状真菌能够分泌完整的纤维素降解酶组分,较细菌纤维素酶产量高,且易于分离,因此在纤维素酶生产菌的研究中以对丝状真菌最为集中。通过理化诱变、细胞融合等遗传操作方法选育和改良高产菌株,是提高丝状真菌的纤维素酶产量,改良纤维素酶系组分的有效方法。丝状真菌纤维素酶属于诱导型酶系,研究丝状真菌纤维素酶及其相关调节基因的表达调控机制,不仅具有重要的理论意义,而且为通过基因工程方法靶向改造菌株提供了背景资料,有利于提高纤维素酶的产量。目前国内外主要围绕木霉和曲霉对丝状真菌纤维素降解酶类进行研究,已经在基因组学、转录组学以及蛋白质组学方面取得了一定进展,而对青霉的纤维素降解酶系研究较少。本论文从斜卧青霉在纤维素诱导与葡萄糖阻遏条件下基因组表达谱的差异出发,研究在诱导与阻遏条件下菌体基因表达的变化情况,为揭示纤维素酶的表达调控机制提供了丰富的数据资料。此外,我们还建立了斜卧青霉的表达系统,对在表达谱中得到的显著差异基因的功能进行了验证,为在斜卧青霉中进行基因工程改造奠定了基础。本论文的主要研究结果如下:�τ没�谛乱淮鶶���庑虻氖�直泶锲追治黾际跹芯啃蔽郧嗝褂盏加胱瓒�通过新一代���测序技术的数字表达谱分析方法,我们构建了斜卧青霉在诱导与阻遏条件下的两个表达谱数据库。阻遏条件下总共得到了���,��醪�序标签,其中包括����种不同的标签,诱导条件下得到了����种���,��醪庑虮昵�A礁霰泶锲资�菘獾谋冉辖峁�允荆�泶锉妒�浠�笥��谋泶锉昵┕灿��,��郑�渲校�谙宋�靥跫�律系�����疓��的表达标签有�,��郑�碌�����疓��的表达标签�,��帧8��山东大学博士学位论文�
酶基因及调节基因的表达变化水平水平分析。结果表明,在诱导条件下删。基因的转录水平上调最明显,提高了�����且倍数差异在�兑陨献魑O灾�钜斓谋曜迹�颐堑玫搅擞盏继跫�下显著上调的表达标签���郑�灾�碌鞯谋泶锉昵���种。将表达标签与斜卧青霉���基因组数据进行比对,结果显示,数据库���蟹直鹩����ズ����サ谋泶锉昵┍榷缘讲慰蓟�蛏希�从氩慰蓟�虮榷�上的标签进一步与基因组序列进行比对,其中又有�.�%和�.�%的表达标签得到比对,最终表达标签中大约有�%能够比对到斜卧青霉���基因组上。分析比较比对后的表达谱数据库中的基因,以�����并且变化倍数差异在�兑陨衔O灾�钜毂泶锉曜迹�玫搅嗽谟盏加胱瓒籼跫�拢�泶锼�较灾�差异的基因���觯��ㄓ盏继跫�孪灾�系鞯��个基因和显著下调的基因���觥S盏继跫�卤泶锵灾�系鞯幕�虬�ǘ嘀帜局氏宋�亟到饷咐嘁约捌�它糖苷水解酶类基因,显示这些基因转录的共调控。对诱导条件下表达显著下调标签的注释显示,多个初级代谢相关酶类、转运蛋白、转录因子等基因显著下调表达。对差异基因进行基因功能富集性分析,结果表明,斜卧青霉���在诱导与阻遏条件下的基因表达以胞外木质纤维素降解酶基因最为显著。��檬凳庇ü舛�縋�方法验证数字表达谱分析中得到的差异显著的纤维素使用实时荧光定量��际醵孕蔽郧嗝怪泄丶�南宋�孛富�蚪�辛俗B�大约��叮�浯问莄��基因提高了约��叮琧��基因转录水平提高了约��叮琧��基因和���基因转录水平提高了相同倍数约�倍,而����因与其他基因的转录情况不同,转录水平在诱导条件时微弱下调了���丁6�在诱导条件下调节蛋白基因��下调了���叮琣��碌髁�.�倍,��下调了���叮�胂宋�孛富�蛳啾龋�骺鼗�虻谋浠��炔⒉幻飨浴U庑┍浠��果与表达谱分析结果基本一致。通过与实时荧光定量��椒ǖ谋冉希�橹ち�数字表达谱分析技术在丝状真菌中用于纤维素酶基因及其调节基因转录分析的可信性。另外,在两种分析方法中关于����虻玫搅讼喾吹慕峁�琑���方法检测到的该基因表达水平变化趋势表现出与其他纤维素酶基因不同,对此,我们斜卧青霉基因表达谱的差异分析研究�
触,而非转化子在葡萄糖条件下�菇�艘号菪退堪彼岬鞍酌富�虻那贸�靥澹�⑹酝ü��蚯贸�姆椒ㄑ芯�对斜卧青霉在两种条件下的��咸烟擒彰富钚宰隽私�徊窖芯俊=峁�允荆�盏�条件下胞外�て咸烟擒彰富钚韵灾�哂谧瓒籼跫�碌拿富睿����葡萄糖苷酶蛋白量较阻遏