实验七-血清丙氨酸氨基转移酶.doc

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了解丙氨酸氨基转移酶测定原理及方法。
二、实验原理
丙氨酸氨基转移酶(ALT)又称谷—丙转氨酶(GPT)。它催化L—丙氨酸和L—谷氨酸之间氨基的转移,反应式为:
***酸与2,4—二硝基苯肼作用生成***酸二硝基苯腙。此二硝基苯腙在强碱溶液中显红棕色,色泽深浅与产生的***酸多少即酶活性成正比。
三、仪器和试剂
:37℃水浴恒温装置,试管和试管架,吸管,722型分光光度计。
:
⑴ mol/L磷酸盐缓冲液。
⑵丙氨酸氨基转移酶基质液:,?—***戊二酸30毫克, mol/L磷酸盐缓冲液约20毫升中,用1mol/L NaOH (),再加磷酸盐缓冲液至100毫升。4~6℃中保存,并加一至二滴***仿,防止细菌分解作用。
⑶ 2,4-二硝基苯肼溶液: 溶2,4-二硝基苯肼200毫克于热1 mol/L HCl中,并用1 mol/L HCl加至1升刻度,避光保存。
⑷ mol/L NaOH溶液。
⑸***酸标准液(2mmol/L):溶***酸钠22毫克于缓冲液100毫升中,存放冰箱,此溶液在数天内是稳定的。
四、实验步骤
      按下表加试剂(毫升):
加入物(ml) 测定管测定空白管
血清 —
加温至37℃的丙氨酸氨基转移酶基质液
各管分别混和,置37
℃水浴30分钟,取出。
2,4—二硝基苯肼溶液
血清—
各管分别混匀,置37℃水浴20分钟,取出。
mol/L NaOH溶液
在30分钟内用波长505nm比色,以蒸馏水校正零点和100%,读取各管吸光度。测定管吸光度减去测定空白管吸光度后,于标准曲线上查得酶活性单位。
     标准曲线绘制:(所加试剂按毫升计)
加入物(ml) 管号
1 2 3 4 5
***酸标准液(2mmol/L) 0
丙氨酸氨基转移酶基质液
mol/L磷酸盐缓冲液
相当于***酸实际含量(?mol/L) 0
相当于丙氨酸氨基转移酶活力(卡门氏单位) 0 28 57 97 150
各管混匀后置37℃水浴5分钟,加2,4—,置37℃水浴20分钟,取出, mol/L ,于30分钟内用波长505nm比色,以蒸馏水校正零点和100%,读取各管吸光度。以各管读数减去空白(第一管)读数后,以各管吸光度为纵坐标,以各管对应的单位数为横坐标作图,绘成标准曲线,两者应呈直线关系。
不做标准曲线时,可做28卡门氏单位标准管,按下式计算结果:
= 卡门氏单位
五、参考值丙氨酸氨基转移酶