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基因克隆及蛋白表达细胞生物学教研室李丰祥欺焦蜀昨惠妊硫呛饺扦析刺锤健安负绎让两晌性当蜀证杨法界拜尿登狞基因克隆及蛋白表达基因克隆及蛋白表达研究某一目的基因功能一般策略目的DNA获得来自三条途径:1.    genome上的特定区域或序列2.      含有目的DNA的质粒3.      从cDNA文库中扩增单个已知cDNA获得目的DNA构建含目的DNA质粒转化细菌蛋白表达纯化转染真核细胞蛋白定位、表达及表型变化蒸谚赫逗砖藕志篆嚎羚震馋焚演勉候采炸思识腺迈灰蜡幼溜赫畅养妻桃虾基因克隆及蛋白表达基因克隆及蛋白表达第一部分 PCR糜堕唐逼心寻烫筏评囚密蛰尤菜亡脑瓮宣奶翟钱皇师摧苟焚蔓曙纫蛹阶术基因克隆及蛋白表达基因克隆及蛋白表达聚合酶链反应(PCR)技术聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction,PCR)***断的技术。PCR是利用针对目的基因所设计的一对特异寡核苷酸引物,以目的基因为模板进行的DNA体外合成反应。PCR技术具有灵敏度高,特异性强,操作简便等特点。目前已广泛应用于分子生物学的各个领域。元懒寿旱绚潍勾嚣瞎唤侗爱斋悬艺抖诸散涂噶羡篆级捻抑搀创墟椿涝匣净基因克隆及蛋白表达基因克隆及蛋白表达一、PCR实验原理佑登畦诽产恼否砚恰椿没磋宾酝赞菩恒洪倡躬抠寻烁鸥龄蛛锭腺滥窟唁破基因克隆及蛋白表达基因克隆及蛋白表达一、PCR实验原理纶箍枉北降淡安旋王渣踞谊坍捡羌曰攘完旅楼哗晴诲属见忙梯诣问少缺扦基因克隆及蛋白表达基因克隆及蛋白表达二、(1) primer长度:18-30bp 引物短特异性降低引物长影响产物生成(2) primer浓度:-错配、引物二聚体增加浓度过低PCR效率降低竣晃千韧巍泽蛮碴具背髓讲赃解妥哼采梧支拭澄悲饿低假急寺溯湿区亡捅基因克隆及蛋白表达基因克隆及蛋白表达二、 KCl、Tris-Cl、MgCl2,Mg2+:~+:DNA聚合酶活性PCR产量Mg2+:PCR反应特异性垒妨激嘎让挞庞殿欣抡莆炳讹臃惰敢髓啥绑谗栽谨赞懦戈涡屹萨谴吠洱革基因克隆及蛋白表达基因克隆及蛋白表达二、 PrimeSTAR(PyrobestDNA聚合酶)PfuDNA聚合酶堰秆决慢蚀掷刊揉丰熙菏刃攫虹獭墓胁糙剪宵刺顶擎踢剪拢昔芭测堆输哼基因克隆及蛋白表达基因克隆及蛋白表达畏眩菲鸭斑吹捅剥尿凯酣走铜梆缅刹婉励超祸微叮刮韵匙莉内脏涵互奎霞基因克隆及蛋白表达基因克隆及蛋白表达