pcr技术的种类及应用资料.doc

PCR技术的发展及应用
平骏 **********
摘要:聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)是1985年由美国PE- Cetus 公司的科学家Kary Banks Mullis发明的一种可在体外快速扩增特定基因或DNA序列的技术。经历了近30年的技术发展,现如今PCR技术在生命科学研究以及相关的很多领域都得到广泛的应用。本文主要对PCR的基本原理、反应组份作简要的介绍;同时也对在PCR基础上发展起来的相关技术作简要综述。
关键词:PCR技术;PCR原理;PCR新技术
对核酸的研究己有100多年的历史,20世纪70年代初人们就致力于研究基因的体外分离技术,Korana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想,该设想在1985年被Mullis等人实现,他们发明了具有划时代意义的聚合酶链反应[6]。这项新技术是根据生物体内DNA序列能进行快速复制的特点,实现在体外对特定DNA序列进行快速扩增,可在短时间内从试管中获得数百万个特异DNA序列拷贝。PCR技术操作简便、结果可靠,被世界各国广泛应用于医学、农业、考古学等各个领域的基因研究和分析,对分子生物学的发展产生了深远的影响[18]。发明人Kary Banks Mulis也因此荣获了1994年的诺贝尔化学奖。
1、PCR 技术的原理[1,2]
PCR技术是模拟细胞内DNA的天然复制过程,DNA 聚合酶以单链DNA为模板,借助一小段双链 DNA 来启动合成,通过一个或两个人工合成的寡核苷酸引物与单链DNA 模板中的一段互补序列结合,形成部分双链。在适宜的温度和环境下, DNA 聚合酶将脱氧单核苷酸加到引物3,- OH 末端,并以此为起始点,沿模板5,→3,方向延伸,合成一条新的 DNA互补链。简言之,其基本原理包括3个基本反应过程:变性→退火→延伸。PCR 反应的基本成分包括:模板DNA( 待扩增DNA )、引物、4种脱氧核苷酸( dNTPs)、DNA 聚合酶和适宜的缓冲液。每一循环中所合成的新链,又都可作为下一循环中的模板。PCR 合成的特定的DNA序列产量随着循环次数呈指数增加,每完成一次循环需2-4min,2-3h就能将目的基因扩增,从而达到迅速大量扩增的目的。
PCR技术的反应组份
模板DNA
PCR反应的模板可以是单链DNA也可以是双链 DNA,可以是基因组DNA 或 cDNA,mRNA 也能作为PCR的模板,只需用逆转录酶把 mRNA 逆转录为cDNA即可。模板量的多少及其纯度的高低,是PCR成败与否的关键因素之一
[6]。由于PCR反应的特异性由寡聚核苷酸引物决定, 模板DNA不需要高度纯化,但应避免任何蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、能结合DNA的蛋白质及多糖类物质的污染[18]。PCR所需模板DNA的量极微(通常在纳克级范围内),通常适宜的模板DNA浓度为30-50ng,不到1纳克的基因组DNA序列就足以用来进行PCR分析,甚至用1个DNA分子就能扩增出特定的DNA 序列。

A-变性;B-退火;C-延伸
图1 PCR原理(摘自邓小红等, 2007)
引物
引物是PCR特异性反应的关键,PCR引物是一段与待扩增DNA序列互补的寡核苷酸片段,长度大多为 10-30个碱基。一般情况下,一对引物包含5,端与正义链互补的寡核苷酸片段和3,端与反义链互补的寡核苷酸片段,这两个寡核苷酸片段在模板 DNA 上的结合位置之间的距离决定 PCR 扩增片段的长度。PCR 反应成功的关键是设计最佳的引物。引物设计的先决条件是与引物结合的靶 DNA 序列必须是已知的,设计引物时尽可能的选择碱基随机分布的序列,尽量避免多嘌呤、多聚嘧啶或其他异常序列。避免引物自身形成发夹结构等二级结构,尤其是两个引物之间不应存在互补序列,尤其是在引物的3,末端,即使无法避免,其3,端的互补碱基也不能多于2个,以减少“引物二聚体”的形成。否则会影响靶DNA序列的扩增。在合成新链时,DNA聚合酶将单核苷酸添加到引物的3
,末端,因此引物3,端的5- 6 个碱基与靶 DNA 片段的配对必须精确、严格。两个引物中G+ C碱基对的百分比( G+ C%)应尽量相似,若待扩增序列中GC 含量已知时,引物的 GC 含量则应与其类似。一般情况下,设计引物时,G+ C 碱基对含量以40% - 60%为佳,解链温度( melting temperature,Tm) 应高于55℃。
DNA聚合酶
最初的DNA聚合酶是从大肠杆菌中提取得到的DNA聚合酶I的Klenow片段。该片段具有DNA聚合酶活性和3,-5,的外切核酸酶活性,能识别和消除错配的引物末端,以校正复制过程中错配的核苷酸。但是它有一个缺点,即Klenow 片段对热很敏