基于超抗原SEB的小鼠肺癌免疫基因治疗-外科学专业论文.docx

酉直医叠太堂亟±堂焦论銮基因的引物,正向引物序列为:5’.ATG—一3’;反向引物::5’.,-TCACTTCTTCTl’。引物的5’端分别设计有XbaI(TCTAGA)、BamHI()酶切位点。—CMV—GFP中,构建成SEB表达质粒PCDH-SEB-GFP;并用测序方法和酶切方法进行鉴定。3。用脂质体将构建的PCDH-SEB-GFP重组质粒转染体外培养的小鼠Lewis肺癌细胞,并用WestemBlot检测转染细胞中SEB蛋白的表达情况。(3×106个细胞/只),当肿瘤体积约为50ram3时,将小鼠分为实验组、阴性对照组和空白对照组,每组6只小鼠。实验组小鼠瘤内注射PCDH-SEB-GFP质粒,阴性对照组瘤内注射空载质粒PCDH-CMV-GFP,空白对照组注射等体积的磷酸缓冲盐溶液(phosphatebuffersaline,PBS)。质粒注射每3天一次,共3次,每次质粒用量为20ug,脂质体20ul,用无血清培养基调整至lOOul。每2天用游标卡尺测量肿瘤的长径和短径,计算瘤体体积,绘制肿瘤生长曲线,最后一次质粒注射后2天,剥出眼球采血,并处死小鼠,完整剥离肿瘤块,测量肿瘤长径和短径,据此计算瘤体体积,比较各组小鼠瘤体体积;用电子天平称量肿瘤质量,比较各组小鼠平均瘤重的差异。,观察肿瘤组织有无坏死,以及有无炎细胞浸润;用免疫组化方法检测肿瘤组织中SEB表达情况;酶联免疫吸附试验(,ELISA)方法检测各组小鼠血清中细胞因子Y一干扰素(Interferon-?,IFN-?)、肿瘤坏死因子-0【(,【)的浓度。一2一万方数据酉直医抖太堂亟±堂僮j金塞结果: 1、本研究合成的SEB基因长度为801bp,通过琼脂糖凝胶电泳、基因测序鉴定,基因大小及序列与预期结果完全一致。2、成功构建SEB基因表达质粒,测序和酶切鉴定结果与预期结果一致。3、用脂质体方法将PCDH—SEB—GFP和PCDH—CMV—GFP质粒分别转染小鼠Lewis肺癌细胞,24小时后,部分细胞内可见绿色荧光,转染效率约40%:Westernblot实验结果显示,转染PCDH—SEB—GFP质粒的Lewis肺癌细胞中有SEB蛋白表达,而转染空载体PCDH—CMV—GFP质粒的Lewis肺癌细胞及空白组(未转染)无SEB蛋白表达。4、成功构建Lewis肺癌细胞C57小鼠肿瘤模型,小鼠成瘤率100%,成瘤期间小鼠无死亡。实验组(瘤内注射PCDH-SEB-GFP质粒)小鼠平均瘤体体积、瘤体质量小于对照组,空白组小鼠瘤体总体积、质量明显大于其余2组。5、HE染色显示实验组所有小鼠肿瘤剖面见出血、坏死区,阴性对照组少数肿瘤可见灶性小坏死区,空白组肿瘤无明显坏死区域;实验组和阴性对照组有炎性细胞浸润,其中实验组更明显,空白对照组无明显炎细胞浸润;免疫组化实验显示,实验组部分肿瘤细胞表达SEB,其余两组肿瘤内无表达SEB细胞;ELISA结果提示各组细胞因子水平无明显差异。结论:1、通过质粒脂质体转染方法,超抗原SEB原核细菌基因能在Lewis肺癌细胞中表达。2、超抗原SEB基因能抑制小鼠肿瘤生长。关键词:肺癌;免疫基因治疗;葡萄球菌肠***B;质粒一3一万方数据酉直医科太堂亟±堂焦论窒Immuno—herapyofSuperantigenSEBgeneforMiceLewisLungcancerAbstract:BackgroundandObjective:,,becauseoftheprogressofOinl‘,andtechnique,radioclaemotnerapy,application)licationoftreatmenttargetingagainstEGFRmutations,theoverall5-yearsurvivalrateisstilllessthan15%.So,itisofgreatimportancetoexplorenoveltherapeut