基因芯片检测Smad4基因静默对胰腺PanIN细胞基因表达谱的影响-内科学;消化病学专业毕业论文.docx

第一部分 Smad4基因慢病毒siRNA载体的构建及鉴定引言RNA干扰(RNAinterference,RNAi)是指一种分子生物学上由双链RNA诱发的基因沉默现象,其机制是通过阻碍特定基因的翻译或转录来抑制基因表达。目前已有大量研究证实RNAi显示了高效且特异性对靶基因表达的静默作用。外源性干扰序列转导入靶细胞,构建高效、低毒、特异性高的载体是能否成功的关键环节。慢病毒载体不仅较其他逆转录病毒载体有更广的宿主范围,更重要的是能够有效感染非周期性和有丝分裂后的细胞,实现在多种类型的细胞和转基因小鼠中特异而稳定的基因表达的功能性沉默,因此已经成为基因功能研究更强有力的工具。HuX等[17]通过RNAi干扰胰腺癌细胞PANC-1中hENT-1的表达并发现hENT-1静默后,能促进5-FU对PANC-1细胞的作用。ChenY等[18]研究表明,通过RNAi静默EZH2可抑制胰腺癌的生长及远处转移。基于上述理论基础,本研究设计并筛选出能特异性静默PanIN细胞中Smad4表达的最佳siRNA稳定表达质粒,利用Gateway重组技术构建慢病毒载体,并经慢病毒包装,纯化及滴度测定等,转染最佳siRNA表达慢病毒干扰载体进入PanIN细胞,并以blasticidin筛选出稳定细胞系,稳转后细胞命名为PanIN-S细胞,为后续进一步研究Smad4基因在胰腺癌中的生物学功能提供材料学与方法学的基础。材料和方法材料细胞株PanIN细胞为KrasG12D突变小鼠基因打靶胰腺PanIN模型并经体外建系而来;经基因突变分析PanIN细胞中除可检测到K-rasG12D突变外,无p16、p53、Smad4等突变或缺失。LoxP-STOP-LoxP-KrasG12D;Pdx-1/Cre小鼠PanIN模型的建立参见我们前期研究描述[8]。细胞冻存:胰酶消化收获细胞后常温600×g离心5分钟,PBS漂洗,含10%DMSO和20%,按照-4℃30分钟,-20℃2小时,-80℃过夜顺序处理后,液氮保存。细胞复苏与培养:将冻存管取出,立即放入37℃至40℃温水中不断摇晃,使冰冻的细胞液在30秒内解冻,移入无菌离心管,加入含10%胎牛血清DMEM高糖培养液3ml,轻轻吹打成悬液,600×g离心5分钟,吸弃上清液,加入含10%胎牛血清的DMEM高糖培养液5ml,轻轻吹打成悬液,种入25cm2培养瓶,置于37℃含5%C02饱和湿度孵箱培养,次日可见细胞贴壁伸展,换液。3至5天长满瓶底80%%%胰蛋白酶消化传代。传代后每2至3天换液一次,取对数生长期细胞为实验对象。质粒慢病毒载体构建试剂盒BLOCK-iTTMpolⅡmiRRNAiExpressionVectorKitwithEmGFP,-GW/EmGFPmiR均购自Invitrogen公司。。 %胰蛋白酶 Gibco公司二甲亚砜(DMSO) Sigma公司焦碳酸二乙酯(DEPC) 上海生物工程公司Trizol Invitrogen公司酚/***仿 上海生物工程公司PrimeScriptTMRTreagentKit TaKaRa公司PCR扩增试剂盒 天根生化DNAmarkerDL2000 Takara公司琼脂糖 Promega公司5×SDS蛋白上样缓冲液 碧云天公司Smad4抗体 SantaCruz公司β-actin单克隆抗体Sigma公司30%AcrylamideBisacyvlamide 上海生物工程公司4×LowerTris() 上海生物工程公司4×UpperTris()上海生物工程公司RIPA裂解液上海申能***公司ECL-plus试剂盒Amersham公司Lipofectamine2000Invitrogen公司BLOCK-iTTMPolⅡ-GW/EmGFPmiR -2S型电热恒温水浴锅上海天平仪器厂FAA1604电子天平上海天平仪器厂垂直电泳仪及转膜装置Bio-Rad公司凝胶成像系统(GelDoc2000)Bio-Rad公司Allera-21R型低温高速离心机Beckman公司PCR热循环仪美国PE公司紫外分光