高效液相色谱.pptx

主要内容酸性和碱性样品酸碱平衡与反相保留缓冲液的选择pKa与化合物结构的关系离子样品反相分离的优化选择性的控制离子对色谱保留机制初始实验控制保留值范围和选择性离子交换色谱离子交换色谱保留机制方法建立硅胶柱酸性样品和碱性样品为方便讨论,我们定义“离子溶质”为在通常pH范围内含有一个或一个以上酸性或碱性官能团的有机分子。在HPLC分离条件下,离子电荷随pH发生变化的化合物简单地称作酸或碱。在反相色谱(RPC)中, 疏水化合物样品的保留值较大。当某种酸(HA)或碱(B)发生解离,其疏水性将会大大减弱。因此在RPC中的保留值k可能下降10~20倍。几乎所有与pH相关的保留值变化均发生于pKa值±,再加入有机溶剂。选择具体缓冲剂时,应切记的几种因素:缓冲容量UV吸收度其它性质:溶解度、稳定性、与样品和/或色谱柱的相互作用、挥发性、对HPLC系统的腐蚀等缓冲容量缓冲容量由pH、缓冲剂pKa及其浓度决定与样品化合物的情况类似,缓冲剂发生解离的pH范围为pKa±。只有在此pH范围内缓冲剂才能有效地控制pH值。10~50mM浓度的缓冲剂对RPC分离一般足够pKa与化合物结构的关系若不知样品组分的pKa值,可以通过样品的分子结构估计出。较好的流动相pH样品中最常见的酸或碱取代基[-NH2、-N(CH3)2等]、碱性杂环和羧酸(-COOH)基团。与pH有关的保留值变化最可能发生于pH3~6的范围内,不包括烷基***化合物。无论已知还是未知样品,开始RPC方法建立时最好选用pH微小改变不影响分离的流动相(pH<3)哪种HPLC法对离子样品最合适RPC具有简单、应用范围广和较好的柱性能等特点,通常是首先的分离模式。若分离不够理想,还可考虑在流动相中加入离子对试剂。在离子对试剂浓度由零变至最大值时,会有RPC-IPC保留值的连续变化。所以起初的RPC实验有助于后面IPC分离条件的优化选择。对特殊分离目的,可以考虑从离子对或离子交换色谱开始。