FuGENE 转染流程.doc

FuGENEHD真核细胞转染流程细胞和质粒的准备将约5-10×105A549细胞接种于6孔细胞板中,用含10%小牛血清的F-12k培养过夜,约60%~80%铺满时用于转染。注:一般荧光试验细胞稀一点为宜;WB试验细胞密一点为宜转染时所用质粒均用转染专用质粒抽提试剂盒无菌提取,抽提后测定其浓度和纯度,±(OD260/OD280)的质粒用于转染,质粒提取的具体步骤按说明书提供的方法进行。(注:质粒浓度测定未必可行,需同时进行酶切和PCR鉴定方可。)按照转染剂量,计算质粒使用浓度转染流程注:由于不同转染试剂对质粒大小、性质、转染量、细胞的种类有很强的特异性,必须谨慎选择转染试剂。以多次转染成功使用的转染试剂为佳。将培养板中的上清弃去,用细胞用无抗无血清F12K洗涤三次后,每孔加入800ul无抗无血清F12K。取出FuGENEHD转染试剂,使其温度上升到室温。计算好质粒、转染试剂、以及无抗无血清F12K的量,最终液体总量为100ul。准备好无菌指形管,按计算结果加入90-98ul的无抗无血清F12K,加入2ug质粒,振荡器混匀;随后加入6ulFuGENEHD转染试剂,立即震荡混匀(转染试剂加入时不能沾到管壁上!)室温静置7-12分钟后,将质粒:转染试剂混合液均匀滴加在细胞平板孔中,吹打混匀或者震荡混匀。放入37℃培养箱孵育。转染后2h后加入含有血清的F12K,使血清终浓度达到1-4%,-2ml。细胞平板放入37℃培养箱培养24-48h。转染后特定时间点,用4℃预冷的PBS漂洗细胞3次,加入含有PMSF的Western细胞裂解液冰上裂解15min。,12,000rpm离心10min,取上清加入5×SDS上样缓冲液,混匀后置于沸水浴中煮沸10min。剩余样品冻存-20℃冰箱备用。