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共培养技术用于体外构建组织工程软骨的实验研究中文摘要
共培养技术用于体外构建组织工程软骨的实验研究
中文摘要
一、人骨髓间充质干细胞与人软骨细胞的分离培养
目的:探索人骨髓间充质干细胞(human bone marrow mesenchymal stem cells,
hBMSCs)与人软骨细胞(human Articular Chontrocytes,hACs)的体外分离及培养过
程,并对其进行鉴定;尝试利用转化因子β1(Transforming growth factorβ1,TGF-β1)
诱导 hBMSCs 向软骨细胞分化。
方法:取 5~8 岁儿童四肢长骨骨折需髓内钉固定者,抽吸其钻孔后流出的骨髓,
通过分离、离心获得细胞,采用低糖 DMEM 培养基进行体外培养,采取流式细胞仪
对培养的细胞进行鉴定;使用倒置显微镜观测细胞形态及生长状况,绘制 hBMSCs
生长曲线。利用 TGF-β1 诱导 hBMSCs 向软骨细胞分化。对诱导后的细胞进行阿利新
蓝染色、蕃红花-亮绿染色检测细胞蛋白聚糖﹙Aggrecan,GAG),免疫组织化学染色
检测 II 型胶原。
取多指(趾)患儿切除下来的关节软骨,分离、消化获得软骨细胞,鉴定同 hBMSCs
诱导软骨细胞。
结果:hBMSCs 呈现贴壁生长,约 2ml 骨髓中获得的 hBMSCs 经 10 天左右可长
满六孔板的一孔。传代后,其第一代~第五代生长旺盛,培养至二十代渐出现凋亡。
第三代 hBMSCs 经流式细胞仪检测 CD34、CD45 表达阴性,CD29 表达阳性。利用
TGF-β1 诱导后的 hBMSCs 其阿利新蓝、蕃红花-亮绿及免疫组化 II 型胶原染色表达
阳性。
多指(趾)软骨细胞 2 周长满六孔板的一孔。鉴定结果同 hBMSCs 诱导软骨
细胞。
结论:1、在体外成功分离、培养了 hBMSCs 和 hACs。
2、hBMSCs 可来源于 5~8 岁儿童四肢长骨骨髓。
3、成功利用转化因子β1 诱导 hBMSCs 分化成软骨细胞。

I
中文摘要共培养技术用于体外构建组织工程软骨的实验研究
二、人骨髓间充质干细胞与人软骨细胞共混培养体外构建组织工程软骨
目的:研究 hACs 与 hBMSCs 直接接触共培养的最佳比例;比较混合培养与
TGF-β1 诱导 hBMSCs 体外构建组织工程软骨的效果。
方法:取上述分离培养后第三代 hBMSCs 和第三代 hACs 以 2:1、1:1、1:2
的比例共培养并接种于丝素蛋白支架(实验组 A、B、C)。同时建立诱导剂诱导第三
代 hBMSCs 向软骨细胞分化并接种于丝素支架的对照组 D;建立单纯第三代 hACs 接
种于丝素支架的对照组 E。保持各组细胞总数一致。将细胞-支架复合物进行体外培
养 3 周,采用倒置显微镜、大体形态、组织学 HE 染色、II 型胶原染色、阿利新蓝比
色法测 GAG 含量及 Hoechst33258 荧光法行 DNA 定量分析进行观察。
结果:各组细胞在丝素蛋白三维支架上均生长良好;各组细胞支架复合物外观大
小无明显差异。A 组(hBMSCs:hACs=2:1)与 D 组(TGF-β1 诱导组)形成的细
胞支架复合物弹性、光泽较差,组织学染色见细胞增殖少,细胞外基质分泌水平较低,
GAG 与 DNA 定量分析结果低于其他三组。C 组(hBMSCs:hACs=1:2)构建的细
胞支架复合物具有最佳的弹性与光泽,组织学染色见细胞支架结合紧密,细胞增殖较
多,胞外基质丰富,GAG 与 DNA 定量分析结果最高。B 组(hBMSCs:hACs=1:1)
与 E 组(单纯 hACs 组)体外构建的组织工程软骨质量相当。
结论:1、hBMSCs 与 hACs 之间的相互作用有利于软骨细胞外基质的产生,比
例为 2:1 时即可获得与 TGF-β1 诱导 hBMSCs 相当的成软骨效应。
2、hBMSCs 与 hACs 直接接触共培养比例为 1:2 时具有最佳的成软骨
效应。

关键词:骨髓间充质干细胞,软骨细胞,诱导,组织工程软骨,共培养

作者:刘尧
指导老师:王晓东
张亚
II
The experimental study of co-culture technology for the construction of engineered cartilage in vitro Abstract

The experimental study of co-culture technology for the
construction