氨基酸的分离鉴定(纸层析法).docx

蒄氨基酸的分离(纸层析法)莃一、实验原理腿1、层析法又称色谱法,是一种物理的分离方法。利用混合物中各组分物理化学性质的差异(如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等),使各组分以不同程度分布在固定相和流动相两相中,并使各组分以不同速度移动,从而得到有效的分离。蒅操作方式:纸层析、薄层层析、柱层析等膆分离机理:分配层析、吸附层析、离子交换层析、凝胶层析、亲和层析等肂2、纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法,展层溶剂由有机溶剂和水组成。滤纸纤维上的羟基具有亲水性,在滤纸上水就被吸附在纤维素的纤维之间形成固定相。当有机溶剂(流动相)沿纸流动经过层析点时,层析法上溶质就在水相和有机相之间不断进行分配。由于溶质就在水相和有机相之间不断进行分配。由于溶质中各组分的分配系数不同,移动速率也不同,因而可以彼此分开。艿分配系数=溶质在固定相中的浓度溶质在流动相中的浓度袆物质被分离后在滤纸上的移动速率用Rf值表示:薃Rf=原点到层析点中心的距离原点到溶剂前沿的距离袁只要条件(如温度、展层溶剂的组成)不变,Rf值是常数,故可根据Rf值作定性依据。艿氨基酸无色,利用茚三***反应,可将氨基酸层析点显色作定性、定量用。芆二、实验器材莅标准氨基酸溶液、滤纸、层析缸、保鲜膜、剪刀、毛细管、电吹风。袃三、实验试剂荿1、酸相溶剂:V[正丁醇()]:V[88%甲酸]:V[水]=15:3:2蚇2、显色贮备液:V(***-异丙醇):V(甲酸):V(水)=20:1:5螃四、实验操作蚂1、点样葿量取30mL层析溶剂、1mL显色贮备液于层析缸中,混匀密闭,静置。肈戴好手套,在桌上铺好一层保鲜膜。取一张干净滤纸,将其剪彩为18cm*14cm。在纸的一端距边缘2cm处用铅笔轻轻划一条直线,在此直线上等距离分出几个点作为点样原点。蒅用毛细管将标准氨基酸和未知样品分别点在点样点上,每次点样后用电吹风冷风吹干再点下一次,点样点直径不超过5mm。蒁2、层析与显色蕿将滤纸卷成圆筒形,用钉书针固定成圆筒状,纸的两边不能接触。膅将滤纸垂直放入盛有展层剂的层析缸中,迅速盖紧层析缸盖(点样点的一端朝下,展层剂液面需低于点样线1cm左右)。羃待溶液前沿线距滤纸末端1~2cm(展层长度10cm,约2h)后,取出滤纸(需带上手套),用铅笔将前沿线作一标记。剪去缝合线,电吹风热风吹干(通风橱中进行),即可看见层析斑点。芀3、结果处理蚈用铅笔将层析图谱上的斑点圈出,分别测量点样点到层析点中心和点样点到层析前沿的距离,计算各种标准氨基酸的Rf值,并根据样品分离的情况鉴定混合样品中氨基酸的组分。薆五、结果与讨论蚅1、层析图谱芃2、数据处理螈羇Gly肃Phe肂Pro袈His莈样品Y09袅中心到原点距离/..——————3、将样品的层析图谱与标准氨基酸层析图谱对比得出,样品中含有的氨基酸是:苯丙氨酸、脯氨酸和组氨酸。样品层析图谱中最下方的斑点难以判断是组氨酸还是甘氨酸,结合Rf值和斑点的形状与颜色,初步判断是组氨酸。4、本次层析的结果不好,各标