预处理对培养乳鼠心肌细胞缺氧复氧损伤的保护作用实验及研究.pdf

预处理对培养乳鼠心肌细胞
缺氧复氧损伤保护作用的实验研究
硕士研究生朱志军
指导教师李继良教授
专业名称外科学
摘要
一次或几次短暂的心肌缺血再灌注可以减轻随后长时间缺血再灌
注引起的心肌损伤,这种现象叫缺血预处理。除了缺血,用缺氧及多
种药物也能引发类似的心肌保护作用,称为缺氧预处理、药物预处理。
在不同种属的动物,如狗、家兔、大鼠、猪和人的心脏中都存在这种
现象。预处理保护作用机制的阐明对多种心脏疾病的预防和治疗有重
要作用。本实验的目的是观察缺氧预处理、药物预处理对心肌细胞抗
缺血再灌注损伤的作用,验证文献报导,并从蛋白激酶角度探讨
预处理机制。、房法在培养的乳鼠心肌细胞上,用缺氧复氧损伤模拟
缺血再灌注损伤,观察缺氧、蛋白激酶激动剂受体激动
剂去甲肾上腺素及加用预处理对心肌细胞抗缺血再灌注损伤的作用,
并从蛋白激酶蛋白激酶抑制剂玩对心肌细胞抗缺血再灌注损伤
的影响。即心肌细胞分为组对照组,缺氧复氧
损伤组缺氧预处理组预处理,去甲
肾上腺素预处理组,缺氧预处理组去
肾上腺素组。行模拟缺血再灌注后,测定心肌细胞存活率,
培养液中乳酸脱氢酶、肌酸激酶及其同工酶
含量和心肌细胞内丙二醛、超氧化物歧化酶含量。
结果显示与对照组比较,在缺氧复氧损伤组,心肌细胞存活率、细
胞内含量均降低漏出量和细胞内含量
均升高,说明缺氧复氧模拟了缺血再灌注对心肌细胞的损
伤作用。经缺氧、处理的个组与缺氧复氧损伤组比较,
该组的心肌细胞存活率、细胞内含量均升高
漏出量和细胞内含量均降低,说明这些处理方式对
心肌细胞有保护作用。加用,的两个组与相应的无的俩组比较,
细胞存活率、含夏均有显著差异得
诱论。缺氧预处理对乳鼠心肌细胞有保护作用。蛋白激酶
激动剂和受体激动剂去甲肾上腺素能引发预处理现象。
蛋白激酶抑制剂能阻断预处理的保护作用。证明蛋
白激酶参与了预处理过程并可能在其中起关键作用。
关键词预处理缺氧预处理心肌保护蛋白激酶
飞么、






终一玩
预处理对培养乳鼠心肌细胞
缺氧复氧损伤保护作用的实验研究
硕士研究生朱志军
指导教师李继良教授
专业名称外科学
前言
预先短暂缺血可减轻随后长期缺血所造成的心肌损伤的现象称为
“缺血预处理”。因能调动机
体的内源性抗损伤机制,使机体对缺血损伤发生主动性适应反应,其
理论及实际意义巨大,引起了广泛关注,迄今已进入了大量深入细致
的研究。但预处理的机制尚未完全阐明,己发现
许多因素直接或间接地引起蛋白激酶激活,
因而有作者认为此为预处理的“共同通路”侧。
作为机体内源性保护现象,预处理不仅存在于完整器官的缺血再
灌注损伤过程, 也存在于离体细胞的缺氧复氧
损伤过程。心肌培养作为一种心肌
模型是药理学、生理学常用的研究方法。本实验通过培养乳鼠
原代心肌细胞,建立心肌缺氧复氧损伤模型,观察短暂缺氧、。受体
激动剂和激动剂、抑制剂对心肌细胞生存率及生化指标的影响,
从角度探讨预处理的作用及机制,为临床应用提供实验依据。
材料和方法
一实验动物
系大鼠,生后天。本校动物室提供
二主要试剂及配制
培养基美国公司出品。取培养基干粉一袋,
加去离子水调值负压抽滤除菌保存。用时加
入小牛血清
激动剂,美国
公司出品。
一异哇琳硫酞一甲基呱嚓抑制剂,美国
公司出品。
胰蛋白酶上海化学试剂厂出品。配成浓度,抽
滤除菌。
新生小牛血清杭州生物试剂厂出品,无溶血现象,分
钟灭活。
试剂盒南京建成生物工程研究所出品。
其余试剂为国产分析纯
三,主要仪器
自动生化分析仪日立型
,培养箱型
倒置显微镜重庆
四,原代心肌细胞培养方法
选新生两日内大鼠,无菌剪取心室,冷冲洗心脏内的
血块,剪碎成‘的小块,加入的胰蛋白酶,置℃水浴中
搅拌,搅拌速度。分次消化,每次约分钟。胰蛋白酶消化
过程约重复次,收集除第一次以外的细胞悬液于离心管中,冷却
至离心分钟,细胞沉淀物用磷酸盐缓冲液
冲洗两次后,用含小牛血清的培养基制成
的细胞悬液,台盼蓝染色成活率在以上,接种于的培养瓶
中,然后再置于培养箱中孵育小时,去除贴壁的非心肌细
胞,未贴壁的心肌细胞移入其它培养瓶中,放入高湿度的
箱中,每小时更改培养液,贴壁生长天,按下述方法鉴别为心肌
细胞后,于实验前小时换为无血清培养基,随机分组后进
入实验。
五心肌细胞的识别与鉴定
一是培养的心肌细胞和非心肌细胞,在倒置显微镜下它们的形状
有所不同心肌细胞的特征为细胞质颜色较深,有颗粒样物质,略显
粗糙细胞核小,圆形,颜色