NCBI Primer-BLAST使用方法.doc

Primer-Blast介绍Primer-BLAST,在线设计用于聚合酶链反应(PCR)的特异性寡核苷酸引物。Primer-BLAST可以直接从Blast主页(/)找到,或是直接用下面的链接进入:.gov/tools/primer-blast/这个工具整合了目前流行的Primer3软件,再加上NCBI的Blast进行引物特异性的验证。Primer-BLAST免除了用另一个站点或工具设计引物的步骤,设计好的引物程序直接用Blast进行引物特异性验证。并且,Primer-BLAST能设计出只扩增某一特定剪接变异体基因的引物–animportantfeatureforPCRprotocolsmeasuringtissuespecificexpression(注:没办法准确的翻译,只好作罢,汗!)。Primer-BLAST有许多改进的功能,这样在选择引物方面比单个的用Primer3和NCBIBLAST更加准确。Primer-BLAST的输入Primer-BLAST界面包括了Primer3和BLAST的功能。提交的界面主要包括三个部分:targettemplate(模板区),theprimers(引物区),和specificitycheck(特异性验证区)。跟其它的BLAST一样,点击底部的“Advancedparameters”有更多的参数设置。模板(Template)在“PCRTemplate”下面的文本框,输入目标模板的序列,essionNumber。如果你在这里输入了序列,是用于引物的设计。Primer-BLAST就会根据你输入的序列设计特异性引物,并且在目标数据库(在specificitycheck区选择)是唯一的。引物(Primers)如果你已经设计好了引物,要拿来验证引物的好坏。可以在PrimerParameters区填入你的一条或一对引物。并且选择好验证的目标数据库(在specificitycheck区选择)。根据需要可设置产物的大小,Tm值等。特异性(Specificity)在specificitycheck区,选择设计引物或验证引物时的目标数据库和物种。这一步是比较重要的。这里提供了4种数据库:RefSeqmRNA,Genome(selectedreferenceassemblies),Genome(allchromosomes),andnr(thestandardnon-redundantdatabase)。前两个数据库是经过专家注释的数据,这样可以给出更准确的结果。特别是,当你用NCBI的参考序列作为模板和参考序列数据库作为标准来设计引物时,Primer-BLAST可以设计出只扩增某一特定剪接变异体基因的特异引物。selectedreferenceassemblies包括以下的物种:human,chimpanzee,mouse,rat,cow,dog,chicken,zebrafish,fruitfly,honeybee,Arabidopsis,和rice。Nr数据库覆盖NCBI所有的物种。实例分析用人尿嘧啶DNA糖基化酶(uracil-DNAglycosylasegenes,UNG,GeneID:7374)的两个转录本序列作为一个例子来分析。UNG1的序列长一点(NM_0033