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Clock基因对雄性小鼠生殖功能影响
(作者:___________单位: ___________邮编: ___________)
作者:何煊成姝婷梁鑫刘延友汪宇辉江舟王正荣
【摘要】目的:通过干扰小鼠睾丸精子节律基因Clock的表达,研究Clock对雄性小鼠生殖能力的影响。方法:通过RNAi技术,向小鼠睾丸注射Clock干扰质粒干扰雄性小鼠睾丸节律基因Clock的表达。研究干扰Clock基因后精子数量、精子活力、体外受精率和雌鼠胎仔数变化,以及对精子顶体内透明质酸酶活性、芳香基硫酸酯酶A的含量影响。结果:Clock干扰质粒在体内可影响雄性小鼠的胎仔数,但注射干扰质粒后小鼠精子计数、精子活力及体外授精率无明显变化,精子顶体内透明质酸酶活性和芳香基硫酸酯酶A含量也无明显变化。结论:节律基因Clock与雄性小鼠生殖能力有密切关系。
【关键词】 Clock基因;RNA干扰;圆形精子;顶体
自然界中,近日节律基因广泛存在于生物体内,调控着机体的生命活动。在所有生物体内存在类似的包括Clock、Period等节律基因的转录和转录后调控所形成的分子振荡。其中Clock作为近日节律的核心基因,其表达的蛋白Clock与Bmal1形成异二聚体,在近日节律分子振荡中发挥着重要作用。近来研究发现,小鼠生精过程中圆形精子的顶体具有明显的Clock的表达[1]。而在睾丸中,Clock表达的圆形精子期是小鼠生精周期中顶体发育的关键时期[2],利用RNA干扰(RNAi)技术,干扰Clock小鼠睾丸中的表达,发现雄鼠睾丸Clock蛋白的表达明显下调,顶体酶活性明显下降,生殖功能明显下降[3],提示节律基因Clock可能与精子的受精能力有关。本文利用RNA干扰(RNAi)技术,干扰Clock在小鼠睾丸中的表达,进一步探讨Clock基因对小鼠生殖功能影响的机制。
1 材料与方法
材料
动物 SPF级ICR小鼠,雄鼠6~8w,雌鼠4~6w,由四川大学华西医学中心实验动物中心提供。在12L∶12D光暗循环下自由饮食,雌雄分笼饲养,标准小鼠笼具。
主要试剂 Clock干扰质粒和阴性对照质粒(由本实验室提供),小鼠芳基硫酸酯酶A(ASA)ELISA 检测试剂盒(Unionhonest公司生产),其余试剂均由实验室提供。
方法
体内实验(胎仔数) 20只雄鼠随机分为干扰组(RNAi)和对照组(Control),每组10只。乙醚麻醉,固定双侧睾丸,分别用微量注射器将干扰质粒(干扰组) 和空质粒(对照组)于双侧睾丸各注射20μl。注射后16d的13∶00-14∶00对雌鼠进行腹腔注射PMSG(孕马血清促性脉激素),46-48h后腹腔注射hCG。雌鼠注射HCG(人绒毛膜促性脉激素)后的当天将两组雄鼠按雌雄2∶1 的比例合笼。雌鼠受孕后立即处死雄鼠,测定精子数量以及精子活力。合笼后受孕的雌鼠大约在21d 开始产仔,分别计数每只雌鼠的胎仔数。
精子计数雄鼠处死后,立即剪开附睾尾, ml T6(人脉巴细胞亚群分样)+ 15 mg·ml-1 BSA(牛血清白蛋白)培养基的表面皿中,37℃、5%CO2孵箱预平衡过夜。随后将附睾尾剪成四段,在37℃、5% CO2孵箱中孵育30min,让精子充