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clock基因干扰质粒的构建及干扰效率测定
(作者:___________单位: ___________邮编: ___________)
作者:付天明鲁芳刘延友汪宇辉江舟甘露薛建新邹晏王正荣
【摘要】目的:构建clock基因的干扰质粒,为深入研究clock基因在信号转导通路中的作用提供有效手段。方法:采用Mfolder生物软件选择2个clock基因干扰位点,并根据3个干扰片段及一个阴性对照片段,定向克隆到pGenesil1干扰载体并测序验证。将干扰质粒及对照质粒分别转染至NIH3T3细胞,并通过检测RTPCR产物量以获得干扰效率。结果:RTPCR产物检测结果显示干扰质粒pGenesil1/clockⅡ干扰效率最高,其clock表达量降低了74%,而pGenesil1/clockⅠ干扰组clock表达量只降低了2%。结论:成功构建了对clock基因具有显著干扰效率的pGenesil1/clockⅡ干扰质粒,为进一步研究clock基因的功能奠定了基础。
【关键词】时间生物学;生物节律;干扰质粒;RNA干扰;RTPCR;clock基因
时间生物学(Chronobiology)是当前生命科学的热点领域,其对生物节律的研究以新颖而独特的观点揭示着自然界和人类社会的纷繁现象,并从本质上阐释生命活动的内在规律。自1985年第一个与生物钟相关的基因period从果蝇体内被成功克隆以来,一系列节律基因(Circadian gene)比如clock,rigui,bmal1,timeless,cry,frq,vvd,noc,kai等被陆续发现[1-7]。他们在许多基本生物功能,包括体温[8]、呼吸[9]、睡眠[10]、进食[11]、血压[12]、血糖、内分泌[13,14]等诸多稳态中发挥着关键作用,构成生物节律的固有物质基础。clock基因作为调控生物节律现象的核心基因之一,对维持正常的近日节律(Circadian rhythm)起着关键作用[15]。目前与clock基因功能相关的研究在不断继续,而至从RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术问世以来,它已经成为一项非常特异、高效的工具被广泛应用于各种基因功能的研究中。RNA干扰本来是指外源和内源性双链RNA在生物体内诱导同源靶基因mRNA特异性降解,从而导致转录后基因沉默的现象,而在功能基因组学与疾病基因组学领域,生物学家则利用RNA干扰技术特异性剔除或关闭目的基因的表达,从而研究目的基因的功能和特性[16,17]。
本文旨在构建针对clock基因的高效干扰质粒,从而实现clock基因在细胞水平和整体动物水平的表达抑制,为我们深入研究clock基因在信号转导通路中的作用提供有效帮助。
1 材料与方法
材料
MEM培养基购自Gibco公司,新生小牛血清购自Hyclone,胰蛋白酶购自Gibco公司。35mm培养皿、多孔细胞培养板购自Corning Incorpora
ted。Lipofectamine 2000阳离子脂质体和TRIzol试剂均购自Invitrogen公司,HindⅢ、BamHⅠ酶、DNA连接试剂盒和RTPCR检测试剂盒以及SYBR Prime Script RTPCR Kit试剂盒购自TaKaRa公司。质粒提取试剂盒和胶回收试剂盒购自Omega公司。RPMI Medium 1640培养基购自Gibco公司。Fugene6转染试剂购自罗氏公司。小鼠肺成纤维细胞株NIH3T3由本实验室提供。
方法
siRNA的设计合成以小鼠clock cDNA序列为模板,根据干扰质粒设计原理[18],同时结合Mfolder生物软件对clock mRNA二级结构的分析结果,确定两个作用干扰位点,分别合成clock干扰质粒(武汉晶赛生物工程技术有限公司)。
重组干扰质粒构建与鉴定将合成的2个目的片段和1个阴性对照片段分别经退火处理,从而得到3对siRNA序列,分别命名为RNAiclockⅠ、RNAiclockⅡ、NC。pGenesil1干扰质粒(图1)经BamHⅠ和HindⅢ双酶切、纯化,然后通过DNA连接试剂盒与3对siRNA序列连接,构建干扰质粒,分别命名为pGenesil1/clockⅠ、pGenesil1/clockⅡ、pGenesil1/NC。提取质粒DNA,并进行序列分析(上海生工)。
图1 pGenesil1/clock干扰质粒
细胞培养、转染快速复苏NIH3T3细胞后加入到RPMI Medium 1640完全培养基中,于5%CO2孵箱37
℃静置培养,以每孔2×105个细胞接种于六孔板,通过Lipofectamine20