FicolinA的克隆、 蛋白表达和抗体的制备与鉴定.doc

FicolinA的克隆、蛋白表达和抗体的制备与鉴定
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【摘要】目的: 克隆小鼠ficolinA(mouse ficolinA)基因, 构建在真核及原核表达载体, 并在大肠杆菌中表达和鉴定其蛋白, 并制备其抗体, 以进一步用于研究小鼠ficolinA的功能。方法: 用RTPCR的方法从新生7 d的C57BL/6小鼠肝脏中运用GeneRacer kit扩增ficolinA cDNA片段, 并将该片段分别插入pVAX1真核表达载体及pGEXKG 原核表达载体中, 实现插入基因的融合, 在IPTG的诱导下在大肠杆菌中表达。用GSTSepharose 4B的柱子对表达的融合蛋白进行纯化, 用SDSPAGE和Western blot对表达产物进行鉴定。制备ficolinA的多克隆抗体并对其效价进行测定。结果: 成功地构建了pVAX1ficolinA真核表达载体及pGEXKGficolinA原核表达载体, 并在大肠杆菌中获得高效的表达, 表达产物的相对分子质量(Mr)同预期值相一致。并且成功制备了多克隆抗体。结论: 成功地构建了重组表达载体pVAX1ficolinA及pGEXKGficolinA, BL21中表达了ficolinA蛋白, 为下一步研究小鼠ficolinA的功能奠定了基础。
【关键词】小鼠ficolin
A; 基因克隆; 蛋白表达; 抗体
纤维胶凝蛋白(ficolin)存在于多种动物和人体内, 组织分布广泛。作为一种转化生长因子1结合蛋白(TGFβ)从猪的子宫内膜中分离出来。Ficolin 与甘露聚糖结合凝集素(mannanbinding lectin, MBL)具有类似的结构和功能, 属于补体凝集素的一种。它们是天然免疫中一种重要的“一线防御”分子, 也是继胶原凝素之后的一种重要的糖类模式识别分子[7]。Ficolin的一级结构和空间结构肽链跟MBL和补体蛋白C1q分子相似。研究显示: ficolin很可能像C1q分子和胶凝素那样, 通过其球形的“头部”与病原体的糖类结合位点结合, 而其胶原样区介导调理吞噬[1, 2]。Ficolin介导的调理吞噬可能通过两条途径进行: 一是与病原体结合后激活MASP, 后者裂解补体产生C3b, C4b等调理素, 以促进吞噬细胞内吞作用。二是直接与吞噬细胞表面的ficolin特异性受体结合, 从而拉进了病原体与吞噬细胞之间的距离, 利于病原体被吞噬和清除[7]。鼠ficolinA与猪的ficolin、人ficolin1、 ficolin、 、 %。鼠ficolinA在肝脏和脾脏中高表达[5, 6]。我们成功克隆了小鼠ficolinA(mouse ficolinA)基因, 构建在真核及原核表达载体上, 纯化了在大肠杆菌中过度表达ficolinA蛋白, 并制备其抗体, 为进一步研究ficolinA蛋白的功能奠定基础。
1 材料和方法
材料孕C57BL/6小鼠(SPF 3级, 雌性)购自武汉大学动物中心, 真核表达载体pVAX
1, 原核