Midkine mRNA在食管鳞癌患者外周血中的表达及其临床意义.doc

Midkine mRNA在食管鳞癌患者外周血中的表达及其临床意义
(作者:___________单位: ___________邮编: ___________)
作者:胡俊,田小强,商延芳,刘飞,刘全俊,黄培林
【摘要】目的:探讨靶基因中期因子(MK)在食管鳞癌患者外周血中的表达及其与食管鳞癌生物学行为的关系。方法:采用巢式RTPCR方法检测54例食管鳞癌患者外周血的MK mRNA。10例正常健康志愿者外周血为阴性对照,11例食管鳞癌肿瘤组织为阳性对照。结果:54例食管鳞癌患者外周血MK %(33/54),并与食管鳞癌患者淋巴结转移有显著相关性(),而健康成人外周血则无一例出现阳性。结论:应用巢式RTPCR方法检测食管癌患者外周血中的MK mRNA具有较高的敏感性和特异性,它有望成为判断食管鳞癌恶性程度、转移、复发和监测疗效的客观指标。
【关键词】中期因子;食管鳞癌;外周血;肿瘤标志物;生物学行为
研究表明,恶性肿瘤在侵袭和转移的早期阶段就有癌细胞入血,即微转移(micrometastasis),它是肿瘤的恶性标志和主要特征之一,也是导致治疗失败和患者死亡的主要原因之一。因此,早期诊断肿瘤微转移是提高恶性肿瘤治疗效果、改善患者预后的有效途径之一[1
2]。而巢式RTPCR可在1×107个单个核细胞中检出1~10个肿瘤细胞,其敏感性、特异性远高于其他方法[3]。迄今为止,国内外尚未见食管鳞癌患者外周血中期因子(midkine,MK)mRNA表达情况的研究报道。本研究拟用巢式RTPCR方法检测食管鳞癌患者外周血的MK mRNA表达,并探讨其与食管鳞癌生物学行为的关系。
1 材料与方法
材料
样本 54例食管鳞癌患者均为东南大学附属中大医院胸外科2004~2006年的住院患者,所有病例均经病理确诊;男40例,女14例;年龄46~83岁,。取术前患者外周血3ml。以11例食管鳞癌肿瘤组织标本为阳性对照,10例健康志愿者外周血为阴性对照。
试剂淋巴细胞分离液和DEPC为南京生兴生物技术有限公司产品,Trizol试剂、RTPCR试剂盒及Taq酶等为日本TaKaRa公司产品。
引物参照有关文献,采用Primer5引物设计软件自行设计,所有引物均由江苏百龙基因有限公司合成。引物序列见表1。
表1 βactin和MK基因的引物序列(略)
Tab1 Primer sequences of βactin and MK
方法
样本处理及总RNA提取抽取术前患者外周静脉血3ml,以枸橼酸钠抗凝,用淋巴细胞分离液按密度梯度离心法常规分离单个核细胞。肿瘤组织以匀浆器研碎得细胞悬液。Trizol一步法分别提取总RNA20
μl,将提取的RNA于紫外分光光度计上定量,并行10%琼脂糖凝胶电泳,以明确RNA未降解。
逆转录合成cDNA和PCR扩增所有标本各取5μl RNA,70℃6min变性,根据TaKaRaRNA试剂盒进行cDNA第1链合成,行MK巢式PCR。第1轮PCR:,10×,25mmol·L-,10mmol·L-