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华中科技大学
博士学位论文
αν和β1整合素通过FAK信号通路介导了Aβ对海马神经元的神
经毒性作用
姓名:张金平
申请学位级别:博士
专业:神经病学
指导教师:唐荣华;薛峥
2011-04
华中科技大学博士学位论文
中文摘要
第一部分原代大鼠海马神经元培养、鉴定及 Aβ
神经毒性模型的建立

目的分离培养原代大鼠海马神经元并鉴定其纯度,建立 Aβ体外神经毒性模型。
方法参照文献方法分离出生 1d SD 乳鼠海马并体外培养神经元细胞,利用 MAP-2
免疫染色鉴定神经元细胞纯度。不同浓度老化的纤维化 Aβ在不同时间点干预
细胞,利用 MTT 比色法测定其细胞活性,寻找建立 Aβ体外神经毒性模型最
佳的时间点和浓度、
结果分离后细胞表现为典型的神经元形态,且经 MAP-2 染色显示分离细胞纯度>
95%,可用于后续的实验。老化的纤维化 Aβ神经毒性呈现干预时间和浓度依赖
性,10 μM Aβ干预 3 d 时细胞存活率为正常组细胞存活率的 %,处理 4 d 时
细胞存活率为正常组细胞存活率的 %。
结论参照文献方法可成功分离并培养原代海马细胞。Aβ神经毒性呈现时间和浓度
依赖性,基于整体实验考虑,选定 10μM Aβ处理海马神经元 3 d 作为后续实验
的造模方法。

关键词原代海马神经元培养;纯度鉴定;神经毒性模型



第二部分慢病毒载体靶向沉默原代大鼠海马神经元 FAK
表达 siRNA 的筛选

目的针对黏着斑激酶(focal adhension kinase, FAK)基因 PtK2 制备靶向性 RNAi 慢
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病毒载体,包装后测定病毒浓度并转染大鼠原代海马神经元细胞,筛选最佳的
感染条件和沉默靶点序列。
方法依据 siRNA 原理设计 3 条大鼠海马神经元 FAK 基因 PtK2 的靶向性 siRNA 序
列(S1, S2, S3),经酶切、转化、PCR 鉴定、阳性克隆测序并慢病毒包装、测定
病毒浓度。利用荧光显微镜观察各组细胞 GFP 表达测定不同条件下慢病毒转染
效率,Real-time PCR 检测神经元细胞 FAK 基因表达,Western blot 检测 FAK
蛋白表达。
结果成功制备 3 条靶向性 FAK 基因 PtK2 的 siRNA 慢病毒载体并成功转染到大鼠
海马神经元细胞中,在感染复数为 10 并加入 5 μg/ml polybrene 条件下慢病毒感
染率达到 90%以上。S1、S2、S3 均可抑制 FAK 基因及蛋白的表达,但 S1 沉默
效果最佳,敲除效率可达到 65%,与正常组比较有均有统计学差异(P<)。
结论筛选出最佳的感染条件及最佳沉默靶向性序列 S1,为后续研究整合素在 AD 发
病中的机制提供了前期实验基础。

关键词 siRNA; 黏着斑激酶;海马神经元



第三部分αν和β1 整合素介导 Aβ对海马神经元的
神经毒性作用及可能机制探讨

目的探讨αν和β1 整合素介导 Aβ对海马神经元的神经毒性作用及可能的作用机制。
方法 1)在 10 μM Aβ处理细胞前,分别用 μg/mL 和 5 μg/mL 的αν和β1 整合素
的特异性拮抗剂 17E6 和 ab58524 预处理细胞 42 h,并通过 MTT、流式细胞
计数、TUNNEL 染色等方法观察各组神经元细胞凋亡变化;
2)利用 siRNA 技术沉默黏着斑蛋白(focal adhension protein, FAK),选取最佳
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的沉默靶序列 T1 并 MOI 为 10 并加入转染增强剂 5μg/mL polybrene 的条件,转
染干预各组细胞并观察各组细胞的凋亡变化;
3) 通过 real-time PCR 和 Western blotting 方法测定各组细胞 FAK、ρFAK 的基
因和蛋白表达情况,探讨αν和β1 整合素介导 Aβ对元代培养海马神经元凋亡
的可能机制和信号通路。
结果 1)MTT 结果显示,17E6 和 ab58524 均可增加 Aβ诱导的海马神经元的存活
率,与 Aβ处理组比较有显著差别(分别为 P<, P<),而 siFAK 后,
17E6 和 ab58524 的神经保护作用明显减弱;
2)TUNEL 染色及流失细胞计数法显示,17E6 和 ab58524 可抑制 Aβ诱导的
海马神经元的凋亡,与 Aβ处理组比较有显著差别