实验四+转氨基作用.doc

实验四转氨基作用(纸层析法)原理氨基酸分子上的氨基转移到α-***酸分子上的反应过程称为转氨基作用(或称氨基移换作用)。转氨基作用是氨酸代谢的重要反应之一,由转氨酶催化。经转氨后,原来的α-—氨基酸变成了相应的α-—***酸,原来的α-—***酸则成为新的、相应的α-—氨基酸。本实验观察谷氨酸与***酸在肌匀浆中的谷氨酸—***酸转氨酶(简称GPT)的催化进行转氨基的过程。然后用纸层析法检查反应体系中丙氨酸的生成。为便于观察转氨基作用,在反应中须加一碘醋酸(或—溴醋酸),以抑制谷氨酸和***酸的其它代谢过程。%NaCl溶液。:/LNaH2PO4溶液19ml混匀,稀释至2000ml。%谷氨酸钾溶液:取谷氨酸1g,加水20ml,用5%KOH调到中性,。%***酸钠溶液:取***。%一碘酸钠溶液:,用5%KOH调到中性,,。(一碘醋酸可用一溴醋酸代替)。%(由实验室准备室制备)取小白兔一只,猛击头部处死后,立即剪颈放血,%NaCl溶液洗去血污后,称取肌肉约100g置电动匀浆器中,。:取小试管2支编号,所加试剂以滴为单位。编号试剂12肌匀浆1010将2号管置沸水浴中5分钟,然后取出冷却1%谷氨酸钾10101%***%—碘醋酸钾55   混匀后同置40℃水浴中保温45分钟(或60分钟)。在保温过程中,时加振摇。取出两管各加入2%醋酸2滴,再同置沸水浴中5分钟,使蛋白质完全凝固,冷却后,离心(200r/min)5分钟,(或静置10分钟),将上清液作氨基酸的纸层析。附氨基酸的纸层析原理层析法又称色层分离法,原指有色物质在吸附剂上因吸附能力不同而得到分离的方法。后来此方法也应用于无色物质的分离。层析法除了吸附层析以外,还有离子交换层析、分配层析和亲和层析等。纸层析是分配层析中的一种。分配层析是利用不同的物质在两个互不相溶的溶剂中的分配系数不同而得到分离的。通常用a表示分配系数。溶质在固定相中的浓度(Cs)a=—————————————溶质在流动相中的浓度(CL)一种物质在某溶剂系统中的分配系数,在一定的温度下是一个常数。纸层析是以纸作为惰性支持物的分配层析,纸纤维上的羟基具有亲水性,因此以滤纸吸附的水作为固定相,而通常把有机溶剂作为流动相。有机溶剂沿着滤纸自下而上流动的,称为“上行法”;自上而下流动的,称为“下行法”。将样品点在滤纸上(此点称为原点),进行展开,样品中的种种溶质(如各种氨基酸)即在两相溶剂中不断进行分配。由于它们的分配系数不同,不同的溶质随流动相移动的速率不等,于是就将这些溶质分离出来,形成距原点不等的层析点。溶质在滤纸上的移动速率用Rf值表示;原点到层析点中心的距离Rf=———————————————————原点到溶剂前沿的距离只要条件(如温度、展开溶剂的组成、滤纸的质量等)不变,Rf值是