人Lrp蛋白多克隆抗体制备.doc

人Lrp蛋白多克隆抗体制备.doc:..人Lrp蛋白多克隆抗体制备作者:于欣平,宋庆贺,侯立朝,杜可军,熊利泽,陈苏民,陈南春,代忠明【摘要】目的::(NiNTA)纯化原核表达的全长Lrp蛋白,:Western印迹结果表明,纯化前后的抗血清在69ku处均检测到目的蛋白条带,,说明吸附纯化后得到高特异性抗血清,其免疫印迹的效价在10-6以上,:成功制备了高效价高特异性的兔抗人Lrp蛋白的多克隆抗体,为Lrp功能的进一步研究提供了重要的实验工具.【关键词】脂多糖类0引言脂多糖(haride,LPS)是细菌内***,是革兰氏阴性(G-)细菌感染的主要致病因子,它与某些炎症的发生密切相关[1]•探讨脂多糖刺激后表达发生改变的基因的功能,有针对性地研究其在LPS信号转导通路中的作用部位及作用性质,(harideresponsedgene,lrp),从LPS刺激后的人牙髓细胞差异表达基因文库中筛选出的应答基因[2],(录入号NM018360).本课题组克隆了全长lrpcDNA编码序列并进行了原核表达与鉴定[3].分析表明,全长人lrp编码528个氨基酸,,(DE3)由本室保存;(Sigma公司);HRP标记的羊抗兔IgG及化学发光底物(Pierce公司);弗氏完全、不完全佐剂(GibcoBRL公司);NiNTA纯化系统(Qiagen公司);纯种新西兰大白兔(第四军医大学实验动物中心).(DE3)感受态细菌,挑单菌落扩大培养后IPTG(),收集菌体,用STE(100g/L蔗糖,10mmol/,1mmol/)洗1遍;离心收集菌体后用STE重悬,超声破碎菌体(整个过程均在冰浴中),13201g,4°C,离心30min,收集包涵体沉淀,再用包涵体溶解缓冲液(50mmol/,1mmol/,100mmol/LNaCl,8mol/L尿素)溶解沉淀,13201g/min,4°C,离心30min,收集上清;用镰离子金属螯合柱(NiNTA)纯化Lrp蛋白(按公司提供的操作说明进行)