分子生物学分子克隆课件.ppt

分子生物学分子克隆分子克隆分子克隆(molecularcloning)是扩增DN***段的数量。一般程序是将需要扩增的DN***段连接到载体(vector)上,再将重组的载体导入宿主细胞中,重组载体在宿主细胞中复制,目的DN***段也同时得到扩增。大肠杆菌的一般性质大肠杆菌是需氧或兼性厌氧细菌,革兰氏阴性,在琼脂培养基上形成圆形、光滑的白色菌落。×106bp的环状染色体DNA。除少数菌株外,大肠杆菌通常不致病。用于分子克隆的大肠杆菌必须具备一些特殊的性质,除极少数例外,用于分子克隆的大肠杆菌都是由K-12菌株衍生而来的。为了消除受体大肠杆菌对外源DNA的限制作用,一般都是选用具有限制缺陷的突变体作为受体菌。大肠杆菌的遗传标记大肠杆菌的遗传标记一般采用三字母命名,如tetr、tets、ampr等,其中上标r代表抗性(resistance),s代表敏感(sensitivity)。当大肠杆菌中含有质粒或噬菌体时,-12(pBR322)、-12(λ)等。大肠杆菌培养基液体培养基(LB液体培养基:1g蛋白胨,,1gNaCl,加重蒸水100ml,,高压灭菌。)、固体培养基(加琼脂或琼脂糖)。有些培养基需要加一些不耐高温的成分,应在培养基高压灭菌后冷却到一定温度再加入,这些成分的母液可通过过滤除菌。在液体培养基中生长用于转化的大肠杆菌受体菌应采用对数期的细菌;用于提取质粒的应采用饱和期的细菌。在经预备实验测出生长曲线后,。在固体培养基上生长划线法或稀释法可得到单菌落。上层琼脂常用于噬菌斑的筛选。浓度较低的上层琼脂与菌液混合后倒在下层琼脂上面。倒置培养。载体载体主要有两类:质粒(plasmid)和噬菌体(bacteriophageorphage)。它们都经过了人工的改造,使其能更好地满足分子克隆工作的需要。它们在宿主细胞中都能够复制,并且在带有外源DN***段时也不影响它们的复制,而单独的外源DNA不能复制。载体还必须带有一些遗传标记,以供选择。质粒(plasmid)的一般性质质粒是在细胞内能自主复制的双链共价闭合环的DNA分子,大小从1kb到200kb不等。大肠杆菌中的F因子就是一种质粒。在质粒上插入一段外源DNA,只要不破坏复制起始点,外源DNA就可以和质粒DNA一起复制。质粒上往往带有编码某些酶的基因。当外源DN***段插入到某一遗传标记基因中,该基因就失去活性,若该基因能够赋予细菌某种性状,根据性状的改变就能筛选出含有重组质粒的菌落。质粒的遗传标记质粒携带的常见基因有β-内酰***酶基因,带有这种质粒的大肠杆菌能够抗氨苄青霉素(ampr);***霉素乙酰基转移酶基因能够抗***霉素(catr)。其他一些遗传标记有lacZ、tetr、strr等。