实验一-鸡新城疫血凝(HA)和血凝抑制(HI)抗体水平测定法.doc

--------------------------校验:_____________-----------------------日期:_____________实验一-鸡新城疫血凝(HA)和血凝抑制(HI)抗体水平测定法鸡新城疫血凝(HA)和血凝抑制(HI)(HA)和血凝抑制(HI)抗体水平测定法,以便检查疫苗使用效果和制定合理免疫程序。 某些病毒(如新城疫病毒,禽流感病毒等)能够与动物的红细胞发生凝集,此即为红细胞凝集现象(HA)。这种红细胞凝集现象可于病毒悬液中加入特异免疫血清所抑制,即为红细胞凝集抑制试验(HI)。-5只,被检鸡15-25只。器材高压灭菌器、滤纸、试管、试管架、离心机、离心管、三棱针、内径2mm聚乙烯塑料管100cm、酒精灯、石蜡、96孔V型微量凝集试验板、微量吸液器、微型振荡器、微量移液器、脱脂棉等。药剂(1)浓缩抗原;(2)生理盐水或磷酸缓冲盐水(PBS);(3)Alsever细胞保存液;(4)红细胞悬液;(5)(1)发现与鉴定病毒:鸡新城疫和禽流感病毒分离后,这些病毒能凝集鸡的红细胞,又能被特异性的已知免疫血清抑制其凝集反应,即可鉴定此病毒。 (2)诊断病毒性疾病:如取同一发病的动物早期和恢复期血清进行红细胞凝集抑制实验,如抗体效价有4倍以上升高,即有诊断意义。(3)免疫机体抗体效价的测定: (ND)的HA和HI(1)试验准备 ① 抗原:一般以鸡新城疫Ⅱ系或LaUra系冻干苗作为已知抗原,进行试验。 ② %细胞悬浮液:由鸡翅静脉或心脏采血,放入含有抗凝剂的灭菌试管(%)内,迅速混匀。如当时不用,可直接采血放入红细胞保存液内(保存液2份,血液1份)于4℃冰箱内可保存两周。红细胞悬液的配制:将血液注入离心管中,经3000转/分钟,离心5-10分钟,用吸管吸去上清液和红细胞上层的白细胞薄膜,将沉淀的红细胞加稀释液(生理盐水)洗涤。再用离心机3000转/分钟离心5-10分钟,弃上清,再加稀释液洗涤,如此反复洗涤三次,将最后一次离心后的红细胞泥,%的稀释度加入稀释液()。 ③ 被检血清:将被检鸡群编号登记,用消毒过的干燥注射器采血,注入洁净干燥试管内(微量法可用孔径2-3毫米塑料管由翅静脉采血),在室温中静置或离心,待血清析出后使用。每只鸡应更换一个注射器,严禁交叉使用。④ 稀释液:为灭菌的生理盐水。⑤ 红细胞保存液的配制方法:,柠檬酸钠(SHOO),柠檬酸(2H20),***,蒸馏水加至100毫升。过滤分装,高压灭菌10分钟,放4℃冰箱保存。(2)红细胞凝集试验(HA)  主要是测定病毒的红细胞凝集价,以确定红细胞凝集抑制试验所用病毒稀释倍数(抗原单位)。鸡新城疫病毒的HA试验与HI试验现采用微量法,以u或v形微孔塑料板代替试管。① 首先用移液器向每个孔加入稀释液一滴()。② ,加入第一孔,反复抽动6次后,,在第二孔反复抽动6次后,,。第12孔不加病毒液为红细胞空白对照。判断:沿着倾斜面向下呈线状流动者为沉淀,表明红细胞未被或不完全被病毒凝集;如果孔底的红细胞铺平孔底,凝成均匀薄层,倾斜后红细胞不流动,说明红细胞被病毒所凝集。如上例:病毒液的HA效价以出现完全凝集的抗原最大稀释度为准。HI试验时,,则应将原病毒液作成64/4=16倍的稀释液。孔号:123456789101112滴度:1:21:41:81:161:321:641:1281:2561:5171:10241:2048对照稀释液252525252525252525252525抗原(病毒)2525252525252525252525红细胞悬液252525252525252525252525作用时间与温度轻轻振荡1-2min静置30-60min结果++++++++++++++++++++﹣﹣﹣﹣﹣注意:+++为完全凝集++为部分凝集—为不凝集(3)红细胞凝集抑制试验(HI试验):新城疫病毒凝集红细胞的作用,能被特异性抗体抑制,因此,可用HI试验(简称血凝抑制试验)测定鸡血清中的HI抗体效价(滴度),并可用标准血清,作新分离病毒的鉴定与未知病毒的诊断。     微量法:具体操作如下: ①,。 ②用移液器吸取被检血清(或高免卵黄抗体)0.