PEG介导的细胞融合.doc

实验七 PEG介导的细胞融合一、实验目的1、理解PEG介导细胞融合的原理,掌握实验方法与技能。2、了解影响细胞PEG介导融合的因素。二、实验原理2个或以上的细胞合并为1个细胞的现象,称为细胞融合。细胞融合的主要方法有病毒法、聚乙二醇(PEG)法和电融合方法。PEG是乙二醇的多聚化合物,一般常用分子质量为MW4000—6000的50%PEG溶液,首先引起细胞的集聚与粘连,然后改变各类细胞膜的结构,使两细胞接触点处脂分子双层发生疏松和重排,由于两细胞接口处双分子层质膜的相互亲合以及彼此的表面张力作用,使细胞发生融合,胞质流通,最后形成融合细胞。细胞融合频率和活力与所用PEG的分子质量、浓度、作用时间、细胞的生理状态与密度等有关。三、实验器材1、材料:新鲜鸡血红细胞2、器具:光学显微镜,离心机,恒温培养箱或恒温水浴锅,电磁炉、离心管、烧杯、容量瓶、木夹子、载玻片,盖玻片等。3、试剂与配制:%:,,·12H2O,·2H2O,,,溶于1000ml重蒸水中。%(W/V)(分子质量=4000)放入50ml瓶中,在电磁炉水浴锅中加热熔化后,再边搅拌继续加热6min。℃,勿让其凝固。℃的GKN液,再充分混匀,置37℃水浴锅中待用。:%(125U/mg),加入40ml全血。可先配100倍母液:%生理氯化钠盐水配成1%肝素溶液(200mg/10ml)。再稀释:按1:40,%氯化钠溶液将母液稀释好,再采鸡血。四、:从在烧杯中事先加入配好的肝素钠(100U肝素/5ml全血),到菜市场采集鸡血,按1:4体积比制成抗凝全血,置于4℃冰箱内可供一周内使用。:(1)取鸡血储备液1ml,加入4ml(4倍体积)%NaCl溶液,上下颠倒轻柔充分混匀后,1500rpm离心5min,轻轻弃去上清液留沉淀。(2)%NaCl溶液,混匀,1500rpm离心5min,轻轻弃去上清液留沉淀。(3)%NaCl溶液,混匀,1500rpm离心4min,轻轻弃去上清液留沉淀。(4)给沉淀中再加入4mlGKN溶液,混匀,1500rpm离心4min,轻轻弃去上清液留沉淀。(5)细胞沉淀中再加入2mlGKN稀释充分混匀使细胞悬浮,37℃温浴静置5min。3. 33%PEG溶液的制备:称取10克PEG(MW=4,000)放入烧杯内,在微波炉上融化之,冷却至50℃,加入2倍体积(15ml)预热至50℃的GKN液,迅速混匀,制成33%PEG溶液,放入37℃水浴中待用。:(5),%PEG溶液,边加边轻摇离心管,加完后轻弹使PEG与细胞充分混匀;(6)然后在