切片、免疫组化步骤.doc

冰冻切片的免疫组化染色步骤速冻组织将组织块平放于软塑料盖或特制小盒内(直径2cm),如组织块小可适量加OCT包埋剂浸没组织,然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内,当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾,此时小盒保持原位切勿浸入液氮内,大约10-20秒组织即迅速冰冻成块。取出组织冰块立即置入-80℃冰箱储存备用,或置于恒冷切片机冰冻切片。冰冻切片4~8mm,冰冻切片后如不染色,必须吹干,储存低温冰箱内,或进行短暂预固定后储存冰箱内保存。室温放置30分钟后,入4℃***固定10分钟。也可根据需要选择其它的固定方式。PBS洗,5分钟×3。用3%过氧化氢孵育5~10分钟,消除内源性过氧化物酶的活性。PBS洗,5分钟×3。下接石蜡切片免疫组化染色操作步骤(滴加一抗开始)。石蜡切片免疫组化染色步骤三步法(以SP试剂盒为例)。,PBS浸泡5分钟,如需采用抗原修复,可在此步后进行。%H2O2室温孵育5~10分钟,以消除内源性过氧化物酶的活性,PBS冲洗,2分钟×3次。~10%正常山羊血清封闭,室温孵育10分钟。倾去血清,勿洗,滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液,37℃孵育1~2小时或4℃过夜。,2分钟×3次。(1%BSA-PBS稀释),37℃孵育10~30分钟;或滴加第二代生物素标记二抗工作液,37℃或室温孵育10~20分钟。,2分钟×3次。(PBS稀释),37℃孵育10~30分钟;或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液,37℃或室温孵育10~20分钟。,2分钟×3次。(DAB或AEC)。,复染,脱水透明(如需要)、封片。二步法(以PV-9000通用型二步法检测试剂盒为例)。,PBS浸泡5分钟,如需采用抗原修复,可在此步后进行。%H2O2室温孵育5~10分钟,以消除内源性过氧化物酶的活性,PBS冲洗,2分钟×3次。,37℃孵育1~2小时或4℃过夜。,2分钟×3次。(PolymerHelper),室温或37℃孵育20分钟,PBS或TBS冲洗,2分钟×3次。(polyperoxidase-anti-mouse/rabbitIgG),室温或37℃孵育20~30分钟,PBS或TBS冲洗,2分钟×3次。,2分钟×3次。(DAB或AEC)。,复染,脱水透明(如需要)、封片。荧光抗体染色方法免疫荧光染色方法注意是检查、鉴定、定位和示踪各种抗原或抗体成分。所以对标本的基本要求是抗原的形态变化尽可能的小,不溶解或不变性,原有位置不扩散或不移位。因此,对标本的处理一般速度要快,温度要低。恒冷切片和涂片较为理想。因此,抗体溶液的pH值和反应温度越低,孵育的时间越长。一般37℃时需要25~60分钟。若要作细致观察或者当天不能进行染色标本的观察,可在5℃中过夜,但染色标本最好是当天观察。1、直接染色法直接染色法是以荧光标记抗体直接与标本内的抗原反应,是免疫荧光技术中最基本、最简单的染色方法。(1)固定:切片或涂片标本用95℃乙醇或***固