细胞复苏与计数.ppt

细胞复苏?从液氮容器中取出冻存管,直接浸入37~40℃水浴中,快速摇晃直至完全融化(最好在1min内完成,融化时水不要浸过冻存管的盖子)?将冻存管直接离心,1500rpm,5min;?弃上清液,加入含10%血清的培养液1ml重悬细胞,将细胞悬液接种于新的培养瓶,加入3ml新鲜的培养液,置37℃培养箱培养。?次日更换一次培养液,继续培养。注意事项?将冻存管放入液氮容器或从中取出时,要做好防护工作,以免冻伤;?冻存和复苏最好用新配制的培养液。细胞计数?细胞计数法是用血细胞计数板计数细胞数目,以调整植入的细胞?血细胞计数板是一块长方形的硬质厚玻璃板,板上有两个刻度平台,每个平台划分为9个大方格,每个大方格的面积为1平方毫米,加特制盖片()。中心为一个大方格以双线等分为25个中方格,每个中方格又分为16个小方格。中心大方格供红细胞计数和血小板计数用,四角的四个大方格供白细胞计数用。?取一套血球计数板,将特制的盖玻片盖在血球计数槽上.?将待测细胞悬液吹均匀,然后吸取少量悬液(10ul)沿盖片边缘缓缓滴入,要保证盖片下充满悬液,注意盖片下不要有气泡,也不能让悬液流入旁边槽中。?将血球计数板置于显微镜的低倍镜下观察,数出四角的四个大格(每个大格含有16个中格)中的细胞数目。?按照下面公式计算细胞密度:?(细胞悬液的细胞数)/ml=四个大格子细胞数/4*104*稀释倍数?说明:?公式中除以4因为计数了4个大格的细胞数。公式中乘以104因为计数板中每一个大格的体积为:(长)×(宽)×(高)= =1*10-4ml?25格*16格的血球计数板RBC计算公式?RBC数/ml=80小格RBC数/80*400*104*稀释倍数细胞计数要点?,要求悬液中细胞数目不低于104个/ml,如果细胞数目很少要进行离心再悬浮于少量培养液中。,否则影响计数准确性。,应充分混匀细胞悬液,尤其时多次取样计数时更要注意每次取样都要混匀,以求计数准确。