各种酶固定方法.doc

一、D380(功能基团为伯氨基)为载体戊二醒交联固定化α一淀粉酶1、固定化载体的预处理吸附树脂采用乙醇、丙酣、蒸馏水交替处理,最后用蒸馆水冲洗至中性备用;离子交换树脂先用蒸馆水漫泡胀润、去杂,然后用HCl、NaOH交替处理,最后用蒸锢水冲洗至中性,置于4"C冰箱保存备用。2、载体选择取处理后载体(湿态),分别加入20mL酶液摇匀,在摇床上室温(25°C摄氏度),100r/min振摇,过夜(12h),弃去上清,并以磷酸缓冲液反复洗涤至洗涤液中无蛋白检出。分别测定固定化酶和上清液的酶活,并计算固定化得率。根据其酶活和得率进行筛选。3、固定化条件的优化取处理后载体(湿态),加入一定量戊二醒,在摇床上定温(25°C),100r/min振摇一定时间,弃去上清,蒸馏水反复冲洗至无戊二醛残留。处理后加入酶液进行固定化,条件同载体选择。4、蛋白质含量测定采用Bradford的方法,以牛血清蛋白为标准曲线。5、酶活收率指实际测定的总的固定化酶活与固定化时所用的全部游离酶活之比。6、%可溶性淀粉为底物,。在60°C预热5min后加入适量固定化酶或稀释至适当浓度的酶液,准确反应5min后,。以稀腆液为空白,于660nm波长下测定其吸光度值。二、D301树脂固定化假丝酵母脂肪酶1、固定化载体及其预处理选择7种工业应用广泛的吸附和离子交换树脂:D301、D113、AB-8、D3520、D4020、D290、D280,购自南开大学化工厂。其中D301为大孔弱碱性苯乙烯系阴离子交换树脂,D113为大孔弱酸性丙烯酸系阳离子交换树脂,AB-8、D3520和D4020为大孔吸附树脂,D290和D280为大孔强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂。大孔吸附树脂:采用乙醇、***、蒸馏水交替处理,最后用蒸馏水冲洗至中性备用;阳离子交换树脂:将树脂用水洗至流出清水后,用2%-4%NaOH浸泡4-8h后用水洗至中性,再用5%盐酸浸泡4-8h,用水洗至pH=6,待用;阴离子交换树脂:将树脂用水洗至流出清水后,用5%盐酸浸泡4-8h后,用水洗至pH=6,再用2%~4%NaOH浸泡4~8h,用水洗至pH7-9,待用。2、脂肪酶的固定化采用单因素对比试验分别进行载体选择、5%戊二醛溶液的加入量、酶液浓度、pH环境和反应时间等条件的优化试验。称取一定量脂肪酶粉溶解于100mL设定pH值的磷酸缓冲液中,并倒入250mL具塞三角烧瓶中,再加入设定量的载体,在5°C-8°C低温冷却液循环泵中,搅拌器搅拌反应24h。过滤,测定上清液的蛋白质含量。抽滤分离固体和上清液,并用同种缓冲液清洗该固定化酶,自然风干,收集后保存待用。三、D380树脂固定果糖基转移酶1、树脂的预处理吸附树脂采用乙醇、丙酣、蒸榴水交替处理,最后用蒸惰水冲洗至中性备用;离子交换树脂先用蒸馆水浸泡胀润、去杂,然后用4%HCl、4%NaOH交替处理,最后用蒸馆水冲洗至中性,置于4°C冰箱保存备用。2、游离果糖转移酶提取方法黑曲霉AS0023细胞的制备见参考文献[12J。称取一定量黑曲霉细胞放入烧杯中,,,在冰浴环境中用超声坡细胞破碎仪处理一定时间后,于4°C下冷冻离心(10000*