[最新]线粒体染色+试验申报+詹纳斯绿b.doc

[最新]:学****超活染色的原理及方法,用詹纳斯绿B给小鼠的肝细胞线粒体染色。:(1)仪器及器材:显微镜、载玻片、盖玻片、镊子、手术剪、解剖盘、胶头滴管、双凹载玻片(2)实验药品:蒸馏水、Ringer液、詹纳斯绿B染液(3)实验材料::(1)活体染色又称超活染色,是指对生命有机体的细胞或组织能着色又无毒害的一种染色方法。这种染色方法常用的是化学染料。目的:显示生活中细胞的某种结构,不影响细胞的生命活动或产生任何的物理、化学变化以致细胞的死亡。应用:研究生活状态下细胞的形态结构和生理病理状态。2)通常把活体染色分为体内活体染色与体外活体染色两类。体外活体染色又称超(活染色,它是由活的动、植物分离出部分细胞或组织小块,以染料溶液浸染,染料被选择固定在活细胞的某种结构上而显色。活体染料之所以能固定、堆积在细胞内某些特殊的部分,主要是靠染料的“电化学”,,,,,特性。碱性染料的胶粒表面带阳离子,酸性染料的胶粒表面带有阴离子,而被染的部分本身也是具有阴离子或阳离子,这样,它们彼此之间就发生了吸引作用。但并非任何染料均可用于活体染色,理论上应选择那些对细胞无毒性或毒性极小的染料,且使用时需要配成稀淡的溶液。一般说来,最为适用的是碱性染料,这可能是因为它具有溶解在类脂质(如卵磷脂、胆固醇等)的特性,易于被细胞吸收。詹纳斯绿B(Janus,,,,,green,,,,,B)和中性红(neutral,,,,,red)两种碱性染料是活体染色剂中最重要的染料,对于线粒体和液泡系的染色分别具有专一性。,,,,,(3)选择活体染料的原则:?性质:有电化学特性?低毒、无毒?低浓度:如实验中使用的是1/5000的詹纳斯绿B染液?专一、特异性:中性红可特异性地对植物液泡染色?常以碱性染料为主,因为碱性染料多可溶于类脂,容易穿膜。:(1)用断头法处死小鼠,置于解剖盘中。剪开腹腔,取出肝脏。,用Ringer液冲洗去血污。(2)滴加1/5000的詹纳斯绿B染液于双凹片的凹穴中,再将上述洗净肝组织移入染液染色20~30mins。以组织边缘被染成蓝绿色为准。(3)吸去染液,重新把组织置于小烧杯中。,用剪刀充分剪碎组织制成悬液。(4)静置上述悬液1~2mins,取静置好的悬液滴片,加盖玻片,高倍镜下观察。:视野中可见比较大的、呈圆形的肝细胞,此种细胞内有一些小颗粒被染成蓝绿色,就是线粒体。视野中也有一些较小的细胞,有些可看到红色,是血细胞。10*40显微镜下观察:,,,,,(1)结果分析:部分肝细胞的线粒体被染成绿色2)注意事项(?取肝组织:取肝组织时,应注意选择肝的边缘部分,这一部分组织的厚度差比较明显;在染色时,须留出一部分肝组织暴露在空气中,以保持细胞呼吸,从而使细胞存活。因此,厚度差比较明显的组织是比较好的实验材料。?洗肝组织:肝组织一定要用Ringer液洗干净,否则观察时会看到很多血细胞,影响效果。?在用染色:染色过程为30mins,在这一过程中,染料中的水分很有可能蒸发,因此,应不时滴加染料。,,,,,?剪肝组织:剪肝组织之前,