体外诱导鼠胚胎干细胞分化为心肌细胞的初步研究.doc

二甲基亚砜诱导胚胎干细胞向心肌细胞分化伴随凋亡现象的研究王秀丽虞星炬马小军中国科学院大连化学物理研究所1802组[摘要]目的:以小鼠胚胎干细胞系(ES-D3)为研究模型,应用诱导剂二甲基亚砜(DMSO)促进ES-D3向心肌细胞方向分化,明确其最佳诱导剂量及应用时间,旨在进一步标准化高效获得ES源心肌细胞的实验方法。同时探讨诱导剂量的DMSO在诱导ES-D3走向分化的同时,是否伴随有细胞凋亡现象的发生。方法:MTT法首先确定DMSO的应用剂量范围,然后设计不同条件培养基对ES-D3进行诱导分化,并在形态学,蛋白质及基因水平对ES源心肌细胞进行鉴定。此外,利用形态学、流式细胞仪等技术对DMSO诱导细胞凋亡进行定性及定量分析。结果:DMSO的低细胞毒性参考剂量为1%,能够高效诱导ES-D3分化为心肌细胞(与阴性对照组比较,p<),%。ES源心肌细胞不但能够表达多种心肌蛋白,而且其肌小节结构发育成熟。RT-PCR结果提示DMSO的促分化效应可能与心肌转录因子GATA-4的表达有关。此外,1%DMSO作用24h后即可诱导ES-D3细胞部分发生凋亡,并且随时间的延长而不断增强,分析该作用可能与凋亡相关基因p53的表达增高有关,而与抗凋亡基因bcl-2无明显相关性。结论:1%DMSO不但能够高效诱导ES-D3分化为心肌细胞,而且还能够以时间依赖的方式诱导ES-D3细胞部分走向凋亡。即:诱导分化与促进凋亡并存于DMSO对ES-D3的作用体系。[关键词](embryonicstemcell,ESC)是一类来自胚胎囊胚期内细胞团的多潜能细胞群,兼具有自我更新、高度增殖和多向分化的能力。1981年,小鼠ES细胞系的成功建立成为干细胞研究领域的重要里程碑[1]。继之,ESC定向诱导分化的研究成为该领域的热点和难点课题。其中研究的较早也较为深入的是ESC向心肌细胞方面分化的研究[2,3]。这不但为发育生物学提供了宝贵的体外研究模型,而且还为心肌损伤后的细胞治疗提供了理想的种子细胞。但是,因ESC自发性分化为心肌细胞的比率很低(<%-%),为了提高心肌细胞分化率,近年来多种化学诱导剂和细胞因子先后应用于ESC向心肌细胞分化的研究[4-6]。其中二甲基亚砜(dimethylsulphoxide,DMSO)的诱导作用受到国内外学者的公认。但由于促进ESC诱导分化的具体机制尚未完全阐明,加之细胞来源及质控标准的差异,各研究对所用剂量、具体诱导方法及诱导分化率报道不一。本研究基于前期工作基础,以ES-D3作为诱导分化的细胞模型,旨在将DMSO诱导ESC向心肌细胞分化的方法进一步标准化。此外,由于DMSO本身生物学效应比较复杂:在细胞生物学研究中,不但具有诱导分化的作用,而且还可促进肿瘤细胞走向凋亡(apoptosis)[7-9]。对于DMSO在诱导ESC走向分化的同时,是否伴随有细胞凋亡现象的发生,国内外尚无相关报道。本研究首次对此进行初步研究,以利于进一步全面阐明DMSO对ESC的复杂生物学效应。(ES-D3),25-30代,由北京大学医学部提供。-DEMEM(Gibco),胎牛血清(Hyclone),二甲基亚砜(S