以绿脓杆菌MexAB-OprM型外排泵外膜蛋白OprM为靶点的抗感染药物筛选模型的建立及初步应用.pdf

中国协和医科大学
硕士学位论文
以绿脓杆菌MexAB-OprM型外排泵外膜蛋白OprM为靶点的抗感染
药物筛选模型的建立及初步应用
姓名:田睿
申请学位级别:硕士
专业:微生物与生化药学
指导教师:左联;余利岩

摘要关键词置碳俚ユ呔恰种匾5脑内感染条件致病菌,常常感染免疫力低下的病人,引起菌血症,肺炎,泌尿系统感染和囊性纤维化等疾病,由于绿脓杆菌经常表现对抗生索的多重高度耐药,一旦感染,临床治疗十分困难。绿脓杆菌的耐药机理十分复杂,但越来越多的研究表明,绿脓杆菌细胞内存在着可以外排多种物质的主动外排系统,在绿脓杆菌的多重耐药性中起着极其重要的作用。我们以绿脓杆菌主动外排系统中最为常见而且最重要的狾型外排泵的外膜蛋白为靶点,进行专一性的外排泵抑制剂的筛选。首先利用分子生物学手段,用椒ù颖曜悸膛Ц司鶳械玫酵馀疟猛饽さ鞍基因,连接到表达载体中,并在大肠杆菌薪蠴蛋白的表达,该大肠杆菌且恢昀醋杂赪,但专一缺失了与蛋白同源的大肠杆菌外膜蛋白的表达菌株。利用这株表达蛋白的大肠杆菌⒘艘桓鲎饔糜谕馀疟猛饽鞍椎囊┪锷秆∧P停四型应用于绿脓杆菌外排泵的专一抑制荆的筛选。对从不同地区、不同植被环境的土壤中分离到的放线菌和真菌,采用不同碳源、氮源和其它营养成分的发酵培养基纸谐跎阜⒔停奂朴τ么四P蜕秆》畔呔驼婢⒔鸵貉觯其中获得阳性菌株个,阳性率约为%左右。绿脓杆菌外排泵筛选模型绿脓杆菌中国协和医科大学硕士研究生学位论文
甌楸に芸研吞桌急ぶ鞅谯展缋级楸た皇墅竺曲..狝——,瑃,琾甌、.
日日—自从人类发现青霉素以来,抗生素工业在全世界得到了迅猛的发展,不断的有新种类的抗生素问世,在人类与疾病斗争中起到了极其重要的作用,很大程度上延长了人类的平均寿命。然而,随着抗生素被越来越广泛的使用甚至滥用,细菌发展出各种各样的机制来抵御抗生素的作用,各种细菌的耐药性越来越强,迫使人们不得不转而开发新种类的抗生素,,人们发现了一种新的耐药机制,利用这种机制,细菌可以将细胞内抗生素的浓度限制在一个非常低的水平,,或称外排泵,细菌外排泵的底物范围非常广泛,可以包括我们目前临床上所使用的大多数抗生素,外排泵使这一类菌具有了可以抵抗多种完全不同的抗生素的能力,这是十分令人惊异的。有些学者由此提出了“药物危机”的概念,因为具有外排系统的细菌可以在某一种抗生素的亚亮恐校岫拙俚谋慊竦昧硕远嘀纸峁购托灾式厝徊煌抗生素的耐药性。在拥有多药外排系统的细菌中,最典型的就是绿脓杆菌了。绿脓杆菌最早是在年从病人化脓的伤口中分离出来,但到目前为止,它仍然是一种重要的院内感染条件致病菌,常常感染免疫力低下的病人,引起菌血症,肺炎,泌尿系统感染和囊性纤维化等疾病。由于绿脓杆菌具有先天的和后天获得的多重耐药性,绿脓杆菌经常表现对口邗0防唷⒙让顾乩唷⑧低@唷⒒前防嗟榷嘀挚生素的多重高度耐药,临床治疗十分困难,已经成为临床医生所面临的治疗难题绿脓杆菌引入瞩目的对多种抗生素的高度耐药主要得益于两种机制,其一是绿脓杆菌外膜的非特异通透性很低,另一个就是绿脓杆菌中存在的主动外排系统。近年来越来越多的证据表明,绿脓杆菌细胞内存在着可以外排多种物质的外排泵,它在绿脓杆菌的多重耐药性中扮演着极其重要的作用。之一。甦中国协和医科大学硕士研究生学位论文
易宓哪谀绿脓杆菌中的外系统都是由跨膜质子梯度能驱动的屯馀疟谩5侥壳拔V挂逊⑾值耐馀畔低彻灿种,分别命现的狾蚆甇屯馀疟谩R话闳衔#浣峁咕扇糠组成,包括一个属于┪镆恢首臃词阶T组件,如,;一个外膜外排蛋白,如,,;和一个膜融合蛋白,其作用是连接两个膜蛋白,如,,,。另外,对绿脓杆菌基因组数据的分析表明,还存在着銮痹诘腞家族外排系统。而在已经发现的滞馀畔低持校琈窃谝吧吐膛Ц司凶成型表达的外排泵,对其先天的抗药性起重要作用,狾远嘀止惴使用的抗生素,如四环素,氯霉素,喹诺酮类抗生素,新生霉素,大环内脂类抗生素,荒邗0防嗫股睾邗0访敢种萍敛叨饶鸵┬浴—型外排泵只在型突变株中表达,对氯霉索,大环内脂类抗生素,新生霉素,喹诺酮类抗生素,四环素耐药,但对邗0防嗫股馗叨让舾小—型外排泵仅在型突变株中表达,对氯霉素,喹诺酮类抗生索,产生耐药性。表达型外排泵的菌株对红霉素和氟喹诺酮类抗生素具有耐受性。外排泵并不表达或表达量很低,如狾屯馀疟弥辉趎屯槐渲曛表达,猳屯馀疟媒鲈趎屯槐渲曛斜泶铩T诼膛Ц司种已知类型外排泵系统中,蛋白参与了其中的三种,狾—和甇A硗猓贠鞍椎幕蛐蛄兄校琽扛叽镌%,说明基因在进化上相当保守。在整个绿脓杆菌基因组中,还包含了约个的同源序列,这提示了蛋白的重要性。本论文的研究目的是建立以绿脓杆菌屯馀疟玫耐饽さ鞍为靶点的抗感