化学发光法研究莲房原花青素.doc

化学发光法研究莲房原花青素化学发光法研究莲房原花青素的体外抗氧化活性和对DNA损伤的保护作用1邓乾春1,陈春艳2,田斌强1,谢笔钧1,~武汉430070,~永州425006,摘要:研究了化学发光法测定莲房原花青素,LSPC,的体外抗氧化活性及其对DNA损伤的保护作用。运用邻苯三酚-鲁米诺化学发光体系测定了LSPC对超氧阴离子的清除作用~硫酸铜-邻菲啉-抗坏血酸-双氧水、硫酸亚铁-鲁米诺-双氧水和硫酸亚铁-鲁米诺三个体系测定了LSPC对羟基自由基的清除作用~双氧水-鲁米诺体系测定了LSPC对体外双氧水的清除作用~采用硫酸铜-邻菲啉-抗坏血酸-双氧水-脱氧核糖核酸测定了LSPC对体外DNA损伤的保护作用。实验结果表明LSPC具有较好的体外清除活性氧和保护DNA损伤的活性。关键词:莲房原花青素,化学发光法,体外抗氧化活性,保护DNA损伤言1(引化学发光法(Chemiluminescence)作为一种灵敏的测定方法被广泛用来检测酶、细胞及生物机体中产生的自由基及反应代谢物,其氧化产物和代谢产物所发出的光可用各种光度计检测[1,2]。由于化学发光法具有灵敏、快速、操作简单和价格低廉等特点,而被广泛用于抗氧化剂的筛选和研究,如多酚、多糖、黄酮类、蒽醌类活性物质等等。NelunbonuciferaGaertn)是我国的特产水生植物,栽培面积超过100万亩,资源十莲(分丰富,主要分布在长江、黄河、珠江三大流域及洪湖、洞庭湖、鄱阳湖、微山湖、白洋淀、巢湖和太湖等湖泊的浅水区。在此之前,国内外对于产量与莲的可食部分几乎相当的非可食部分,尚未能引起人们的重视和利用,更谈不上深入研究。尽管《本草纲目》等我载,但未曾涉及药用和活性成分。莲房原花青素(LSPC)则是本实验室首次从中分离鉴定,并证明其是莲房的主要活性成分之一。已证明LSPC,8]具有抗氧化[3,4]、降血脂[5]、抗心肌缺血[6]、抗肿瘤[7、免疫调节[8]、抗辐射[9]等诸多功能。凌智群等人采用单一化学发光体系测定了LSPC对超氧阴离子和羟基自由基的体外抗氧化活性[10],本文为了进一步评价和了解LSPC在多个体系中的抗氧化活性及其作用机制,以为监测LSPC在提取和纯化过程中抗氧化活性的变化提供可行的体系,本文采用化学发光法测定了LSPC对体外活性氧自由基的清除作用,并首次测定了LSPC对DNA损伤的保护作用。2(材料和方法2(1试剂莲房原花青素(LSPC)(本实验室自制,含量大于纯度98%,(项目编号:20040504013)、国家自然科学基金(项目编号:30270938)资助。-1-0%。产品为浅黄色粉末,得率15%左右);小牛血清蛋白、小牛胸腺DNA、鲁米诺、邻苯三酚、双氧水、硫酸亚铁、邻菲啰啉、抗坏血酸,其余试剂均为分析纯。2(2仪器BPCL型超微弱化学发光测量仪(中国科学院生物物理所),测试条件:Hi-V800;Kv–1;记录的波长范围:180-800nm;温度30?。2(3LSPC对超氧阴离子的清除作用:采用邻苯三酚-鲁米诺化学发光体系[11]/L浓度的溶液,在避光处保存,临用前用双蒸水稀释成1mmol/L的溶液,邻苯三酚用1mmol/,4?冰箱中保存,×10-4mol/L溶液。-NaHCO3缓冲液()用前现配,实验前与1mmol/L鲁米诺以2?1(V:V)混合成鲁米诺和碳酸盐缓冲液混合物。测量时,µL不同浓度的样品(以样品缓冲液为对照),×10-4mol/,(30?),间隔2,记数发光强度,测定300,的总发光积分强度,本底发光强度为未加邻苯三酚时的发光值。2(4LSPC对羟基自由基的清除作用[12-14]2(4(1CuSO4-Phen-Vc-H2O2化学发光体系取50µL样品于样品池(以样品缓冲液为对照)中,µL,1mmol/L邻菲啰啉溶液50µL,µL(),充分混匀,然后再加入100µL1mmol/L抗坏血酸溶液和50µ%H2O2溶液(本底不加双氧水),立即启动化学发光系统,间隔3s记数,记录400s内化学发光动力学曲线。2(4(2FeSO4-Luminol-µL