PCR技术(xh)xhXHPCR技术PCR（PCR.doc

PCR技术(xh)xhXHPCR技术PCR（PCR.docPCR技术实验H的:在启外记性基因的克隆实验原理:利用DNA复制半保留的原理PCR反应五要素:参加PCR反应的物质主要有五种即:引物(PCR引物为DNA片段,细胞内DNA复制的引物为一段RNA链)、.酶、(耐热DNA聚合酶・・Taq酶、)3dNTP、(其中需要Mg2+)。〜100^〜2(+(90°C-96°C):双链DNA模板在热作用下,氢键断裂,形成单链DNA模板DNA的变性:模板DNA经加热至93°C左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使Z成为单链,以便它与引物结合,(25°C-65°C):系统温度降低,引物与DNA模板结合,形成局部双链。模板DNA与引物的退火(复性):模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55°C左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合3•延伸(70°C-75°C):在Taq酶(在72°C左右,活性最佳)的作用下,以dNTP为原料,从引物的亍端-3,端延伸,合成与模板互补的DNA链。引物的延伸:DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基互补配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。PCR反应特点特杲性强灵敏度高简便、快速对标本的纯度要求低电泳检测阴性。(需注意的是有时忘加Taq酶或混乙锭。)引物:引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称,是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题,两条引物一条浓度高,一-条浓度低,造成低效率的不对称扩增,对策为:①选定一个好的引物合成单位。②引物的浓度不仅要看OD值,更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳,一定要有引物条带岀现,血且两引物带的亮度应大体一致,如一•条引物有条带,一条引物无条带,此时做PCR有可能失败,应和引物合成单位协商解决。如一•条引物亮度高,一条亮度低,在稀释引物时要平衡其浓度。③引物应高浓度小量分装保存,防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分,导致引物变质降解失效。④引物设计不合理,如引物长度不够,引物之间形成二聚体等。Mg2+浓度:Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大,浓度过高可降低PCR扩增的特异性,浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。反应体积的改变:通常进行PCR扩增采用的体积为20uK30ul、50ulo或lOOul,应用多大体积进行PCR扩增,是根据科研和临床检测不同H的而设定,在做小体积如20ul后,再做大体积吋,一定要模索条件,否则容易失败。物理原因:变性对PCR扩增来说相当重要,如变性温度低,变性时间短,极有可能出现假阴性;退火温度过低,可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计,检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度,这也是PCR失败的原因之一。靶序列变异:如靶序列发生突变或缺失,影响引物与模板特异性结合,或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列,其PCR