小鼠海马LTP.doc

Morris水迷宫实验是检测动物空间学****记忆功能的重要行为学方法,海马LTP实验可以了解突触可塑性变化,反映行为学的发生机制。脑片是指从动物脑区制备的厚度为100~700μm能够在体外存活一定的时间的脑薄片,脑片技术起始于20世纪50年代Li和McIlwain的离体脑片电生理研究。脑片兼有在体脑实验和离体神经细胞培养的某些特点,在体外48小时内依然能保持良好的活性,离子通道性质不会发生变化,离体脑片保持有完整的神经突起和神经解剖通路,便于研究突触活性。在脑片的电生理过程中排除了活体血压、温度、电解质、血脑屏障等因素的干扰,可以按不同的实验目的直接准确地改变脑片灌流液的成份和条件,如温度、酸度和渗透压、通氧状态、以及离子通道或细胞信号转导通路的阻断剂等;还能借助显微镜准确地放置记录电极和刺激电极。维持脑片活性有两种不同的技术:交界式脑片孵育:脑片部分浸入人工脑脊液(ACSF)中,上表面暴露在湿化的含95%O2和5%CO2的气体,这种孵育方式,脑片得到氧气是通过氧气在脑片上表面的扩散;全浸式脑片孵育:脑片全部浸入在人工脑脊液中,在这种孵育方式中,脑片是从溶解在人工脑脊液中得到氧气。孵育脑片方式的选用取决于实验目的。例如当采用共聚焦成像技术时采用全浸式脑片孵育。这两种不同的脑片孵育方式对脑片的细胞生理有不同的影响,例如,最近研究发现α-钙调蛋白依赖性激酶ІІ的磷酸化,这种酶在LTP诱导中起关键作用,在全浸式脑片中短暂升高,而在交界式脑片孵育方式中则持续降低。脑片切片后,,在恢复和记录过程中不一定要采用同一种孵育方式。离体脑片上做LTP实验,周围环境容易控制,可以人为调节ACSF里面的离子成分到需要的浓度,而且可以持续给予脑片通饱和氧和二氧化碳,维持脑片的活性,还可以控制记录时候的温度,方便给予稳定浓度的药物,可控性比较好,比较适合研究急性药物对突触可塑性的影响。但是对切脑片的技术要求比较高,可以说脑片切的好不好决定实验的成败,在切脑片的时候手法很重要,当中有很多的窍门,一点做不好就会导致实验的失败。而在体实验对于动物手术的要求很高,尤其以刺激和记录电极的定位最为重要,必须严格按照图谱上的位置来放置电极,如果需要重复刺激的话还要用牙科水泥固定电极以防止脱落,术后感染和电极脱落是导致实验失败的常见原因。但是这个实验容易受到动物本身状态的影响,因为有些细胞和体液因子在离体实验中是没有的,对于海马LTP是有影响的,而且在体实验保留的神经通路和联系较离体实验更多,实验机制更复杂,也最能真实客观的反映LTP的变化,据报导在体实验中诱发的LTP可以持续几天甚至几周,而离体脑片上只能持续几个小时。切全脑片和分离海马后再切都可以,但是如果分离海马需要经过一段时间的训练才能取的好。有的文章里面说要切断CA1和CA3之间是为了防止海马脑片从CA3传入CA1的兴奋性纤维自发电活动引起细胞的癫痫样放电,你可以把一片剃须刀片从中间折断成两片,然后取一小截刀刃,插到一根棉签木棍上来切断。,用***麻醉后快速断头,切开头皮去除颅骨和硬脑膜。迅速取出全脑置于0~4℃且用95%的02和5%的C02饱和的人工脑脊液(ACSF)中稍加冷却,其成分为(mmol/L)NaCl120,,,,N