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南方医科大学博士学位论文 2在鼻咽癌顺铂耐药中的作用姓名:谢思明申请学位级别:博士专业:肿瘤病理学与病理生理学指导教师:姚开泰 20080515 博士学位论文 2在鼻咽癌顺铂耐药中的作用研究背景和目的博士研究生: 指导教师: 摘要谢思明姚开泰教授鼻咽癌(Nasopharyngeal Carcinoma,NPC)是一种主要发生在我国南方地区的鼻咽部的恶性上皮性肿瘤。由于NPC发生的部位比较隐蔽,早期症状常不明显而容易被忽略,因此确诊的患者有60%以上都是中、晚期,常伴有转移。对这类患者除了采用常规的放疗外,化疗也是必不可少的一种治疗方法。但是由于耐药性的产生,往往容易导致患者复发,因此对化疗药物耐药性的研究具有重要的临床意义。研究表明,在N-PC化疗中,含铂类方案的治疗效果要优于非铂类方案,而在铂类方案中最常用的是顺铂。目前认为肿瘤细胞对顺铂产生耐药性的机制非常复杂,比较引人关注的就是耐药细胞如何能够阻断顺铂与DNA的结合,而其中能把毒性药物泵出细胞外而使药物蓄积减少的ABC(ATP binding cassette, ABC)转运蛋白家族就成为了研究的热点。 ABC转运蛋白的作用机制主要是通过其跨膜区域与底物结合,通过水解 ATP产生能量而把底物泵出细胞外。目前发现的ABC转运蛋白家族共有48个基因,根据跨膜区域的不同可分为A、B、C、D、E、F、G七个亚族,其中常见的与耐药相关的基因有十个:ABCA2、ABCBl(也称为MDRl、)、I (也称为MRPI)、2(也称为MI冲2、cMOAT)、3、4、5、 6、ll、ABCG2。2不但可在细胞膜表达,也可在细胞核膜表达;2表达降低的时候细胞对顺铂的敏感性增中文摘要加,2表达增加的时候细胞对顺铂的耐药性增加。目前在NPC中尚未 2与顺铂之间关系的探讨,因此本课题拟以NPC为研究对象,探讨 2与顺铂耐药的关系,为NPC的临床化疗提供参考。方法 ,根据对顺铂化疗的情况分为敏感组和不敏感组,2的表达水平,然后对结果进行半定量积分法分析。2的表达与性别、年龄、肿瘤分期、化疗效果及预后的关系。同时根据化疗的方案分为PF(DDP+)、PFB(DDP++ 平阳霉素)、PFD(DDP++艾素)及PV(DDP+长春新碱)组,2 的表达情况进行统计分析。 +5.***脲嘧啶联合进行诱导,经诱导一年左右,用MTT法检测细胞的增殖能力,流式细胞术检测细胞周期的变化: MTT法检测多药耐药逆转剂PSC833作用前后顺铂对耐药细胞及敏感细胞的抑制率,并计算出IC50以及耐药指数;荧光定量PCR法检测十种常见的与耐药相关的ABC转运蛋白在诱导前后mRNA的变化,免疫细胞化学法检测 2蛋白质的表达情况;高效液相色谱法检测PSC833作用前后耐药细胞内顺铂蓄积的变化情况。 ,对CNE2细胞进行RNA干扰,筛选出稳定的干扰株,2在干扰前后mRNA的变化: 2蛋白表达的情况;用 MTT法检测细胞的增殖能力;流式细胞术检测细胞周期的变化;MTT法检测干扰前后顺铂对细胞的抑制情况并计算出IC50:高效液相色谱法检测干扰前后细胞内顺铂蓄积的变化情况。最后通过裸鼠皮下移植瘤实验来探讨干扰克隆在体内对DDP的敏感性。 n 博士学位论文结果 1、2表达及临床意义(1)共收集84例NPC标本。SP免疫组化结果表明,2表达主要定位在细胞膜和细胞浆,少数可见表达于细胞核。经统计分析,2的表达与患者的年龄、性别、临床分期的相关性均无统计学差异()。(2)84例标本中化疗敏感组为50例,2高表达的占34%(17/50); 不敏感组为34例,2高表达的占65%(22/34),2 的表达有显著性差异(Z=,P<),2的表达要高于敏感组,2的表达与化疗效果有关。进一步对化疗方案与 2的表达情况进行分析,2的表达与PFB、PFD、 hip等联合化疗方案的疗效的相关性无统计学差异,而与PF方案的疗效有关(Z=,P<) (3)84例标本中有转移的为74例,2高表达的有36例(50%); 未转移的lO例,2高表达的有3例(30%),2的表达有显著性差异(Z=,P<),2的表达要高于未转移组,2的表达与转移有关。进一步对转移组和未转移组 2表达的关系进行探讨,结果发现在转移组中,化疗 2的表达显著高于化疗敏感组(Z=,P<)。 2、2表达的检测(1) E2 E2/DDP)、DDP+E2 12 E2/DDP+5Fu)后,MTT法检测PSC833作用前后DDP对三种细胞的抑制情况,计算出IC50,E2/DDP、 CNE2/DDP+5Fu对顺铂更加耐药,并能被P